【摘要】：第一部分aBMSC-dECM支架的制作及其性能研究 目的探討通過收集自體骨髓間充質干細胞外基質(autologous bone marrow mesenchymal stem cell-derived extracellular matrix, aBMSC-dECM)制備三維多孔狀支架的可行性,并對支架性能進行分析。 方法分離、培養(yǎng)2周齡新西蘭大白兔骨髓間充質干細胞,原代培養(yǎng)4周后收集其分泌的aBMSC-dECM膜,采用交聯(lián)和凍干技術制備三維多孔狀支架,對支架行HE染色、掃描電鏡、抗壓強度測試。 結果aBMSC-dECM支架呈三維多孔狀海綿樣結構,孔隙分布均勻且有較好的連通性,孔徑大小為304.4±108.2μm；孔隙率為93.3%±4.5%；密度為28.7±1.4mg/ml;抗壓強度為6.8±1.5KPa。 結論通過收集aBMSC-dECM膜可用于制備組織工程支架,該支架材料具有理想的三維空間結構特征及力學特性,有望成為一種具有較高應用價值的組織工程支架。 第二部分aBMSC-dECM支架在軟骨再生中的應用 目的探討aBMSC-dECM支架在軟骨再生中的應用可行性。 方法分離、培養(yǎng)2周齡新西蘭大白兔骨髓間充質干細胞,原代培養(yǎng)4周后收集其分泌的aBMSC-dECM膜,采用交聯(lián)和凍干技術制備三維多孔狀支架。分離培養(yǎng)自體軟骨細胞并植入aBMSC-dECM支架,將細胞-支架復合物分別行體外和裸鼠皮下種植培養(yǎng)制備組織工程軟骨,對照組使用atelocollagen支架。于種植后48h對細胞-支架復合物行Live-Dead染色。于體外培養(yǎng)1周、2周和4周后對組織工程軟骨行組織學分析、Real-Time PCR和Western blotting檢測。于體內(nèi)植入1周、2周和3周后對組織工程軟骨行大體觀察、體積測量、組織學分析、生化成分分析及抗壓強度測量。 結果Live-Dead染色顯示aBMSC-dECM支架內(nèi)的軟骨細胞維持較好的生物活性；與對照組相比,體外培養(yǎng)4周后aBMSC-dECM支架組組織工程軟骨內(nèi)基質含量更多、分布更均勻,特定基因和蛋白表達更高；體內(nèi)植入3周,aBMSC-dECM支架組組織工程軟骨的體積增長和均質性均優(yōu)于對照組,具有更高軟骨基質成分和抗壓強度。 結論aBMSC-dECM支架有利于維持細胞活性和生物學功能,能促進組織工程軟骨的形成,可成為一種具有較高應用價值的組織工程軟骨支架材料。 第三部分aBMSC-dECM支架對自體骨髓間充質干細胞成軟骨分化的作用 目的探討aBMSC-dECM支架對自體骨髓間充質干細胞成軟骨分化的作用。 方法分離、培養(yǎng)2周齡新西蘭大白兔骨髓間充質干細胞,原代培養(yǎng)4周后收集其分泌的aBMSC-dECM膜,采用交聯(lián)和凍干技術制備三維多孔狀支架。將自體骨髓間充質干細胞植入aBMSC-dECM支架,細胞-支架復合物分別行體外和裸鼠皮下種植培養(yǎng),對照組使用atelocollagen支架。體外培養(yǎng)隨機分成四組：①C+組：BMSCs/atelocollagen支架復合物置于含有成軟骨分化誘導因子TGF-β3的培養(yǎng)體系；②E+組：BMSCs/aBMSC-dECM支架復合物置于含有TGF-β3的培養(yǎng)體系；③C-組：BMSCs/atelocollagen支架復合物置于不含有TGF-β3的培養(yǎng)體系；④E-組：BMSCs/aBMSC-dECM支架復合物置于不含有TGF-β3的培養(yǎng)體系；分別于體外培養(yǎng)3d、10d和21d對各組再生組織行組織學分析、Real-Time PCR和生化成分分析。裸鼠皮下種植前,先將aBMSC-dECM支架組和atelocollagen支架組細胞-支架復合物置于不含有TGF-β3的培養(yǎng)體系體外培養(yǎng)1w；分別于體內(nèi)植入后1w、2w和3w對再生組織行大體觀察、體積測量、生軟骨分化檢測和成骨分化檢測。 結果體外培養(yǎng)過程中,與C+組和C-組相比,E+和E-組再生組織中蛋白聚糖、Ⅱ型膠原表達逐漸增多,COL2A1、ACAN及SOX9基因表達量持續(xù)升高,再生組織的總DNA含量維持在一個較高水平,GAG含量和GAG/DNA比值持續(xù)升高。體內(nèi)培養(yǎng)初期,aBMSC-dECM支架組再生組織中蛋白聚糖、Ⅱ型膠原表達呈強陽性,但隨時間延長表達逐漸減弱,成骨分化逐漸增強；而atelocollagen支架組在體外培養(yǎng)過程中再生組織體積逐漸縮小,基質中未見蛋白聚糖、Ⅱ型膠原表達,至后期組織大部分區(qū)域被新生骨組織替代 結論aBMSC-dECM支架可促進和維持自體骨髓間充質干細胞成軟骨分化,有利于組織工程軟骨形成。 第四部分aBMSC-dECM支架結合骨髓刺激術修復關節(jié)軟骨缺損的實驗研究 目的探討結合aBMSC-dECM支架植入,對骨髓刺激術(BMS)修復關節(jié)軟骨缺損的作用。 方法選取健康成年新西蘭大白兔24只,分離、培養(yǎng)骨髓間充質干細胞,原代培養(yǎng)4w后收集其分泌的aBMSC-dECM膜,采用交聯(lián)和凍干技術制備三維多孔狀支架。于雙側膝關節(jié)股骨滑車部位制作全層軟骨缺損模型,右側膝關節(jié)(BMS組)行骨髓刺激術修復軟骨缺損,左側膝關節(jié)(BMS+Scaffold組)在完成骨髓刺激術后,在缺損處植入aBMSC-dECM支架。分別于術后6w,12w對兩組再生軟骨行大體觀察、組織學檢查及評分、生化成分分析。 結果術后12w,與BMS組相比,BMS+Scaffold組再生軟骨覆蓋更完整,與周邊正常軟骨整合較好；BMS+Scaffold組再生軟骨基質中蛋白聚糖、Ⅱ型膠原含量和分布接近正常軟骨,以圓形、橢圓形透明軟骨樣細胞為主,纖維走行垂直于關節(jié)面,ICRS評分顯著高于BMS組；BMS+Scaffold組再生軟骨基質中DNA及GAG含量接近正常軟骨。 結論結合aBMSC-dECM支架植入可有效提高骨髓刺激術修復軟骨缺損療效,具有較高的臨床應用價值。
[Abstract]:The first part is about the fabrication and performance of aBMSC-dECM scaffold.
Objective To investigate the feasibility of fabricating three-dimensional porous scaffolds by collecting autologous bone marrow mesenchymal stem cell-derived extracellular matrix (aBMSC-dECM) and analyze the performance of the scaffolds.
Methods Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) from 2-week-old New Zealand white rabbits were isolated and cultured. The aBMSC-dECM membrane secreted by BMSCs was collected after 4 weeks of primary culture. Three-dimensional porous scaffolds were prepared by cross-linking and freeze-drying techniques. The scaffolds were stained with HE, scanning electron microscopy and compressive strength was tested.
Results The aBMSC-dECM scaffold was a three-dimensional porous sponge-like structure with uniform pore size of 304.4 (+ 108.2) micron, porosity of 93.3 (+ 4.5%), density of 28.7 (+ 1.4 mg/ml) and compressive strength of 6.8 (+ 1.5 KPa).
Conclusion The aBMSC-dECM membrane can be used to fabricate tissue engineering scaffolds. The scaffolds have ideal three-dimensional structure and mechanical properties, and are expected to be a tissue engineering scaffold with high application value.
The second part is the application of aBMSC-dECM scaffold in cartilage regeneration.
Objective to investigate the feasibility of aBMSC-dECM scaffold in cartilage regeneration.
Methods Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) from 2-week-old New Zealand white rabbits were isolated and cultured. The aBMSC-dECM membrane secreted by BMSCs was collected after 4 weeks of primary culture. Three-dimensional porous scaffolds were prepared by cross-linking and freeze-drying techniques. Tissue-engineered cartilage was prepared and the control group was treated with atelocollagen scaffold.Cell-scaffold complex was stained with Live-Dead 48 hours after implantation.Tissue-engineered cartilage was cultured in vitro for 1 week,2 weeks and 4 weeks.Histological analysis,Real-Time PCR and Western blotting were used to detect tissue-engineered cartilage.Gross appearance of tissue-engineered cartilage was observed after implantation for 1 week,2 weeks and 3 weeks. Observation, volume measurement, histological analysis, biochemical composition analysis and compressive strength measurement.
Results Live-Dead staining showed that the chondrocytes in the aBMSC-dECM scaffold maintained good biological activity; compared with the control group, the aBMSC-dECM scaffold group had more tissue-engineered cartilage matrix content, more uniform distribution, higher specific gene and protein expression after 4 weeks of culture in vitro; after 3 weeks of implantation, the aBMSC-dECM scaffold group had higher tissue-engineered cartilage content, more uniform distribution, and higher specific gene and protein expression. The volume growth and homogeneity were better than those of the control group, with higher cartilage matrix composition and compressive strength.
Conclusion The aBMSC-dECM scaffold can maintain cell viability and biological function, promote the formation of tissue-engineered cartilage, and can be used as a tissue-engineered cartilage scaffold material with high application value.
The third part is the effect of aBMSC-dECM scaffold on chondrogenic differentiation of autologous bone marrow mesenchymal stem cells.
Objective to investigate the effect of aBMSC-dECM scaffold on chondrogenic differentiation of autologous bone marrow mesenchymal stem cells.
Methods Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) from 2-week-old New Zealand white rabbits were isolated and cultured. The aBMSC-dECM membrane secreted by BMSCs was collected after 4 weeks of primary culture. Three-dimensional porous scaffolds were prepared by cross-linking and freeze-drying techniques. The control group was cultured with atelocollagen scaffolds and randomly divided into four groups: (1) C + group: BMSCs / atelocollagen scaffold complex was placed in the culture system containing TGF - beta 3; E + group: BMSCs / aBMSC - dECM scaffold complex was placed in the culture system containing TGF - beta 3; and (3) C - group: BMSCs / atelocollagen scaffold complex; Group E: BMSCs/aBMSC-dECM scaffold complex was placed in a culture system without TGF-beta 3. Histological analysis, Real-Time PCR and biochemical analysis of regenerated tissues were performed on 3, 10 and 21 days after culture in vitro, respectively. Gross observation, volume measurement, chondrogenic differentiation and osteogenic differentiation were performed at 1, 2 and 3 weeks after implantation.
Results The expression of proteoglycan and type II collagen in E + and E - regenerated tissues increased gradually, the expression of COL2A1, ACAN and SOX9 genes increased continuously, the total DNA content of regenerated tissues maintained at a higher level, the GAG content and the ratio of GAG to DNA increased continuously. The expression of proteoglycan and type II collagen was strongly positive in regenerated tissues, but gradually weakened with time, and the osteogenic differentiation was gradually strengthened; while the volume of regenerated tissues in atelocollagen scaffold group was gradually reduced, no proteoglycan was found in matrix, and the expression of type II collagen was found in most areas of the late tissue, which was then regenerated by bone tissue. Replace
Conclusion The aBMSC-dECM scaffold can promote and maintain the chondrogenic differentiation of autologous bone marrow mesenchymal stem cells and is beneficial to the formation of tissue-engineered cartilage.
The fourth part is aBMSC-dECM scaffold combined with bone marrow stimulation to repair articular cartilage defects.
Objective to investigate the effect of bone marrow stimulation (BMS) combined with aBMSC-dECM stent implantation on repairing articular cartilage defects.
Methods Twenty-four healthy adult New Zealand white rabbits were selected to isolate and culture bone marrow mesenchymal stem cells. The aBMSC-dECM membrane secreted by bone marrow mesenchymal stem cells was collected after primary culture for 4 weeks. Three-dimensional porous scaffolds were prepared by cross-linking and freeze-drying techniques. After bone marrow stimulation, aBMSC-dECM scaffolds were implanted into the left knee joint (BMS+Scaffold group). The regenerated cartilage of the two groups were observed, histologically examined and scored, and biochemical compositions were analyzed 6 and 12 weeks after operation.
Results At 12 weeks after operation, the regenerated cartilage in BMS+Scaffold group was more complete and integrated with the surrounding normal cartilage than that in BMS+Scaffold group, and the contents and distribution of proteoglycan and collagen type II in the regenerated cartilage matrix in BMS+Scaffold group were close to that of normal cartilage, mainly round and oval hyaline chondrocytes with the fibers running perpendicular to the articular surface. The levels of DNA and GAG in BMS+Scaffold group were higher than those in BMS group.
Conclusion The combination of aBMSC-dECM stent implantation can effectively improve the effect of bone marrow stimulation in repairing cartilage defects and has high clinical value.
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R318.08

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本文編號：2221676