【摘要】：一種理想的組織工程人工神經(jīng)應(yīng)該是由種子細(xì)胞、生物材料、細(xì)胞外基質(zhì)以及誘導(dǎo)和促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)的因子等幾部分構(gòu)成的有機(jī)統(tǒng)一體。在課題組前期的工作中我們已經(jīng)先后通過探討了組織工程人工神經(jīng)的種子細(xì)胞—雪旺細(xì)胞培養(yǎng)方法,獲得了較大數(shù)量、較高純度的雪旺細(xì)胞。通過改良去細(xì)胞同種異體神經(jīng)橋接體的制備方法,獲得了較為理想的人工神經(jīng)天然支架。隨后的雪旺細(xì)胞與去細(xì)胞同種異體神經(jīng)橋接體的體外組織相容性研究也證實(shí)：采用胎兔坐骨神經(jīng)培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞能在用成年兔坐骨神經(jīng)制備的去細(xì)胞橋神經(jīng)接體中生長(zhǎng)良好,并且具有遷移成行的特性。在前期研究基礎(chǔ)上本課題將嘗試將血管內(nèi)皮細(xì)胞與雪旺細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)移植以促進(jìn)組織工程人工神經(jīng)血管化,進(jìn)一步探討組織工程人工神經(jīng)再血管化策略。為此,本課題擬從以下三個(gè)方面開展研究：(1)將胎兔雪旺細(xì)胞復(fù)合體橋接修復(fù)兔坐骨神經(jīng)缺損的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究,明確胎兔雪旺細(xì)胞神經(jīng)復(fù)合體修復(fù)周圍神經(jīng)缺損可行性；(2)體外雪旺細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究,探討將雪旺細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)的最適比例；(3)將血管內(nèi)皮細(xì)胞與組織工程人工神經(jīng)中的種子細(xì)胞-雪旺細(xì)胞聯(lián)合種植至預(yù)先制備好的去細(xì)胞同種異體神經(jīng)段中,嘗試先在體外對(duì)神經(jīng)移植體行預(yù)血管化,并用這種預(yù)血管化的人工神經(jīng)重建成年兔坐骨神經(jīng)的功能。觀察比較預(yù)血管化處理和不進(jìn)行預(yù)血管化處理兩種移植復(fù)合體對(duì)神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。通過上述三個(gè)方面的研究,探討早期預(yù)血管化移植體對(duì)神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。第一部分種植胎兔雪旺細(xì)胞重新細(xì)胞化的脫細(xì)胞異體神經(jīng)修復(fù)神經(jīng)缺損的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)康模豪锰ネ米巧窠?jīng)培養(yǎng)雪旺細(xì)胞,然后將其在體外與經(jīng)化學(xué)去細(xì)胞處理的同種異體神經(jīng)段形成重新細(xì)胞化的神經(jīng)橋接復(fù)合體,并用于修復(fù)成年兔坐骨神經(jīng)缺損,探討種植雪旺細(xì)胞的去細(xì)胞神經(jīng)橋接復(fù)合體修復(fù)周圍神經(jīng)缺損的可行性。方法：實(shí)驗(yàn)包括胎兔雪旺細(xì)胞培養(yǎng)、去細(xì)胞神經(jīng)橋接體的制備以及去細(xì)胞神經(jīng)橋接體復(fù)合體的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)三個(gè)部分。使用雙酶消化法培養(yǎng)雪旺細(xì)胞并將其種植于經(jīng)3%TritonX-100作用96h后的同種異體神經(jīng)中。實(shí)驗(yàn)組：將胎兔雪旺細(xì)胞神經(jīng)復(fù)合體橋接用于移植修復(fù)成年兔坐骨神經(jīng)缺損。對(duì)照組：?jiǎn)渭儜?yīng)用未重新細(xì)胞化的去細(xì)胞同種異體神經(jīng)段移植修復(fù)成年兔坐骨神經(jīng)缺損。分別觀察兩組坐骨神經(jīng)的再生及功能恢復(fù)情況,觀察兔的足部潰瘍形成及愈合情況。于4周,8周,12周行肌電圖檢查,在光鏡下觀察神經(jīng)軸突的再生情況,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組兩組動(dòng)物分別在術(shù)后第4周、第8周和第12司時(shí)觀察,非常明顯的排斥反應(yīng)均未在手術(shù)操作的局部區(qū)域或全身出現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)組足部潰瘍愈合情況、再生神經(jīng)纖維數(shù)目與對(duì)照組相比有顯著差異(對(duì)照組差于實(shí)驗(yàn)組)。神經(jīng)傳導(dǎo)速度(NCV)的比較：①在術(shù)后第4周時(shí),實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均未出現(xiàn)特別明顯的神經(jīng)傳導(dǎo)；②在術(shù)后第8周時(shí),神經(jīng)傳導(dǎo)速度實(shí)驗(yàn)組為24.80±1.27 m/s,對(duì)照組為18.72±0.81 m/s,T值-10.91,P0.05；③在術(shù)后第8周時(shí),神經(jīng)傳導(dǎo)速度實(shí)驗(yàn)組為37.95±2.43m/s,對(duì)照組為32.58±1.89 m/s,T值-5.01,P0.05。兩組有顯著差異性。神經(jīng)纖維數(shù)目的比較：①在術(shù)后第4周時(shí)實(shí)驗(yàn)為750.65±74.24根,對(duì)照組為543.67±61.42根,T值-5.30,P0.05；②在術(shù)后第8周時(shí),實(shí)驗(yàn)組為2067.83±231.65根,對(duì)照組為1804.50±156.65根,T值-2.29,P0.05；③在術(shù)后第12周時(shí),實(shí)驗(yàn)組為34340.33±124.48根,對(duì)照組為2495.17±154.95限,T值-11.25,P0.05。兩組比較有顯著差異性。結(jié)論：胎兔雪旺細(xì)胞能在經(jīng)去細(xì)胞處理的同種異體神經(jīng)中生長(zhǎng)并發(fā)揮生物活性,種植胎兔雪旺細(xì)胞重新細(xì)胞化后的同種異體神經(jīng)不僅可以為新生軸突生長(zhǎng)提供具有良好空間結(jié)構(gòu)的支架,而且與單純化學(xué)去細(xì)胞處理的異體神經(jīng)相比,重新細(xì)胞化后的同種異體神經(jīng)在誘導(dǎo)和促進(jìn)新生神經(jīng)軸突再生等方面更具優(yōu)勢(shì)。第二部分胎兔血管內(nèi)皮細(xì)胞與胎兔雪旺細(xì)胞在體外共同培養(yǎng)體系的建立目的：在體外將雪旺細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng),建立最適比例的胎兔血管內(nèi)皮細(xì)胞與胎兔雪旺細(xì)胞在體外共同培養(yǎng)體系,為進(jìn)一步探討組織工程人工神經(jīng)再血管化策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：取胎兔坐骨神經(jīng)以及胸主動(dòng)脈采用酶消化法分別進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)胎兔SCs和VECs,隨后將培養(yǎng)好的胎兔SCs和VECs移入含20%胎牛血清的DMEM/F12及M199的混合培養(yǎng)基中,根據(jù)移入的SCs和VECs細(xì)胞數(shù)量比例分別設(shè)為實(shí)驗(yàn)組的A組(1：1)、B組(2：1)、C(4：1)三組,各組DMEM/F12及M199培養(yǎng)基的比例根據(jù)細(xì)胞比例也作相應(yīng)調(diào)整。與此同時(shí),將相同數(shù)量的SCs繼續(xù)進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)并設(shè)為對(duì)照組D。各組分別在細(xì)胞培養(yǎng)后的第1、3、5、7天,對(duì)SCs進(jìn)行計(jì)數(shù)并根據(jù)計(jì)數(shù)情況繪制SCs的生長(zhǎng)曲線。結(jié)果：1隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的增加,各組SCs的數(shù)量也不斷增加,SCs和VECs能夠在同一細(xì)胞培養(yǎng)孔中各自生長(zhǎng)。2在細(xì)胞共同培養(yǎng)第1天,A、B、C三個(gè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組D中的SCs細(xì)胞數(shù)量無顯著性差異(P0.05),在細(xì)胞共同培養(yǎng)的第3天、第5天、第7天,A組和C組SCs計(jì)數(shù)與對(duì)照組D相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),D組的SCs數(shù)量高于A、C兩組；B實(shí)驗(yàn)組的SCs數(shù)量與對(duì)照組D相比則無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),實(shí)驗(yàn)組B與實(shí)驗(yàn)組A、C則有顯著差異(P0.05),B組SCs數(shù)量高于A、C兩組。結(jié)論：利用胎兔坐骨神經(jīng)培養(yǎng)的SCs能夠在體外與利用胸主動(dòng)脈培養(yǎng)的VECs進(jìn)行共同培養(yǎng)；在胎兔血管內(nèi)皮細(xì)胞與胎兔雪旺細(xì)胞體外共同培養(yǎng)的體系中,當(dāng)VECs與SCs的比例為1：2時(shí),SCs的生長(zhǎng)能力及活性維持最好。第二部分胎兔血管內(nèi)皮細(xì)胞與胎兔雪旺細(xì)胞在體外共同培養(yǎng)體系的建立目的：在體外將雪旺細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng),建立最適比例的胎兔血管內(nèi)皮細(xì)胞與胎兔雪旺細(xì)胞在體外共同培養(yǎng)體系,為進(jìn)一步探討組織工程人工神經(jīng)再血管化策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：取胎兔坐骨神經(jīng)以及胸主動(dòng)脈采用酶消化法分別進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)胎兔SCs和VECs,隨后將培養(yǎng)好的胎兔SCs和VECs移入含20%胎牛血清的DMEM/F12及M199的混合培養(yǎng)基中,根據(jù)移入的SCs和VECs細(xì)胞數(shù)量比例分別設(shè)為實(shí)驗(yàn)組的A組(1：1)、B組(2：1)、C(4：1)三組,各組DMEM/F12及M199培養(yǎng)基的比例根據(jù)細(xì)胞比例也作相應(yīng)調(diào)整。與此同時(shí),將相同數(shù)量的SCs繼續(xù)進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)并設(shè)為對(duì)照組D。各組分別在細(xì)胞培養(yǎng)后的第1、3、5、7天,對(duì)SCs進(jìn)行計(jì)數(shù)并根據(jù)計(jì)數(shù)情況繪制SCs的生長(zhǎng)曲線。結(jié)果：1隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的增加,各組SCs的數(shù)量也不斷增加,SCs和VECs能夠在同一細(xì)胞培養(yǎng)孔中各自生長(zhǎng)。2在細(xì)胞共同培養(yǎng)第1天,A、B、C三個(gè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組D中的SCs細(xì)胞數(shù)量無顯著性差異(P0.05),在細(xì)胞共同培養(yǎng)的第3天、第5天、第7天,A組和C組SCs計(jì)數(shù)與對(duì)照組D相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),D組的SCs數(shù)量高于A、C兩組；B實(shí)驗(yàn)組的SCs數(shù)量與對(duì)照組D相比則無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),實(shí)驗(yàn)組B與實(shí)驗(yàn)組A、C則有顯著差異(P0.05),B組SCs數(shù)量高于A、C兩組。結(jié)論：利用胎兔坐骨神經(jīng)培養(yǎng)的SCs能夠在體外與利用胸主動(dòng)脈培養(yǎng)的VECs進(jìn)行共同培養(yǎng)；在胎兔血管內(nèi)皮細(xì)胞與胎兔雪旺細(xì)胞體外共同培養(yǎng)的體系中,當(dāng)VECs與SCs的比例為1：2時(shí),SCs的生長(zhǎng)能力及活性維持最好。第三部分血管化同種異體神經(jīng)復(fù)合體橋接修復(fù)兔坐骨神經(jīng)缺損的實(shí)驗(yàn)研究目的：探討將經(jīng)化學(xué)去細(xì)胞處理的同種異體神經(jīng)復(fù)合體預(yù)血管化處理后移植修復(fù)兔長(zhǎng)段坐骨神經(jīng)缺損的可行性以及早期血管化移植體對(duì)神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。方法：將雪旺細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞在體外聯(lián)合培養(yǎng)成功后將其種植于預(yù)先制備的經(jīng)脫細(xì)胞處理完善的同種異體神經(jīng)段中,制備成預(yù)血管化的人工神經(jīng)并將其用于修復(fù)兔缺坐骨神經(jīng)缺損(實(shí)驗(yàn)組),對(duì)照組移植體中單純種植雪旺細(xì)胞,無血管內(nèi)皮細(xì)胞。術(shù)后4周,8周,16周對(duì)兩組動(dòng)物行肌電圖檢查,觀察神經(jīng)功能恢復(fù)情況,然后,手術(shù)取材,應(yīng)用光鏡、電鏡觀察坐骨神經(jīng)再生和髓鞘形成情況,應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)對(duì)髓鞘厚度以及有髓神經(jīng)纖維軸突的直徑、數(shù)目進(jìn)行量化分析。結(jié)果：1大體觀察,術(shù)后4周、8周、16周兩組動(dòng)物全身及局部均未出現(xiàn)明顯的排斥反應(yīng)。足部潰瘍恢復(fù)情況以及步態(tài)恢復(fù)情況實(shí)驗(yàn)組均優(yōu)于對(duì)照組;2術(shù)后8周實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)傳導(dǎo)速度為23.35±1.05m/s,對(duì)照組為23.11±0.80m/s,T值2.13,P0.05。術(shù)后16周實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)傳導(dǎo)速度為39.52±1.0 m/s,對(duì)照組為38.34±0.15 m/s,T值2.15,P0.05。3脛前肌濕重測(cè)量：4周時(shí)兩組動(dòng)物脛前肌濕重(實(shí)驗(yàn)組2.22±0.13g,對(duì)照組2.20±0.16g)組間無顯著差異(P0.05)。8周時(shí)實(shí)驗(yàn)組3.38±0.11 g,對(duì)照組3.28±0.07g,T值2.89,P0.05,組間有顯著差異。術(shù)后12周實(shí)驗(yàn)組6.10±0.22g,對(duì)照組5.97±0.15g,T值2.14,P0.05,組間有顯著差異。4再生神經(jīng)纖維的數(shù)量：4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組為922.97±25.06,對(duì)照組為901.48±12.39,T值3.26,P0.05,組間有顯著差異。8周時(shí)實(shí)驗(yàn)組為1736.44±36.28,對(duì)照組為1713.51±25.00,T值2.20,P0.05,組間有顯著差異。12周時(shí)實(shí)驗(yàn)組為2840.91±20.93,對(duì)照組為2823.74±14.42,T值2.86,P0.05,組間有顯著差異。5有髓神經(jīng)纖維軸突直徑：4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組為5.83±0.16μm,對(duì)照組為5.58±0.42μm,T值2.27,P0.05,組間有顯著差異。8周時(shí)實(shí)驗(yàn)組為6.01±0.09μm,對(duì)照組為5.87±0.16μm,T值3.09,P0.01,組間有顯著差異。12周時(shí)實(shí)驗(yàn)組為6.11±0.08μm,對(duì)照組為6.00±0.07μm,T值4.62,P0.0001,組間有顯著差異。6髓鞘厚度：4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組為1.95±0.14μm,對(duì)照組為1.70±0.22μm,T值4.10,P0.05,組間有顯著差異。8周時(shí)實(shí)驗(yàn)組為1.99±0.11μm,對(duì)照組為1.85±0.16μm,T值3.10,P0.01,組間有顯著差異。12周時(shí)實(shí)驗(yàn)組為2.03+0.05μm,對(duì)照組為1.90±0.06μm,T值7.16,P0.0001,組間有顯著差異。結(jié)論：應(yīng)用預(yù)血管化的組織工程人工神經(jīng)移植體修復(fù)兔坐骨神經(jīng)缺損能有效地促進(jìn)受損神經(jīng)的功能恢復(fù)。
[Abstract]:An ideal artificial neural stem cell - Schwann cell culture method has been studied in the early stage of the study .
( 2 ) In vitro co - culture of Schwann cells with vascular endothelial cells , the optimal proportion of Schwann cells and vascular endothelial cells was optimized .
Objective : To investigate the effect of transplantation complex of Schwann cells on nerve function recovery in adult rabbits . The experimental results showed that the experimental group and control group were used to repair the sciatic nerve defect of adult rabbits .
At the 8th week of operation , the nerve conduction velocity in the experimental group was 24.80 鹵 1.27 m / s , the control group was 18.72 鹵 0.81 m / s , T value - 10.91 , P0.05 ;
At the 8th week of operation , the nerve conduction velocity in the experimental group was 37.95 鹵 2.43m / s , the control group was 32.58 鹵 1.89 m / s , T value - 5.01 , P0.05 . There were significant differences between the two groups .
( 2 ) At 8 weeks after operation , the experimental group was 2067.83 鹵 231.65 , the control group was 1804 . 50 鹵 156.65 root , T value - 2.29 , P0.05 ;
The results showed that the cultured rabbit Schwann cells were cultured in vitro and cultured in DMEM / F12 and M199 medium .
The number of SCs in group B was significantly higher than that in control group ( P0.05 ) . The number of SCs in experimental group was higher than that in group A and C ( P0.05 ) .
The results showed that the number of SCs and cultured rabbit Schwann cells were cultured in vitro . The results showed that the number of SCs and cultured rabbit Schwann cells were cultured in vitro .
The number of SCs in group B was significantly higher than that in control group ( P0.05 ) . The number of SCs in experimental group was higher than that in group A and C ( P0.05 ) .
The results showed that the nerve conduction velocity was 23.35 鹵 1 . 05m / s in the experimental group and 23.11 鹵 0 . 80 m / s in the control group . There was a significant difference between the two groups . The experimental group was 6.01 鹵 0 . 09渭m , the control group was 3.09 鹵 20.9渭m , the control group was 5.58 鹵 0.16渭m , T value was 4.62 , P < 0.01 , there was a significant difference between the groups .
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R318.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2137328