本文選題：納米顆粒 + 人脂肪來源干細胞�。� 參考：《北京協(xié)和醫(yī)學院》2016年博士論文

【摘要】：干細胞治療為一些傳統(tǒng)治療效果欠佳的疾病和損傷提供了新的治療方法。為了能夠使干細胞發(fā)揮最大的治療效果,我們有必要明確干細胞移植入體內(nèi)是如何存活、增殖、分化以及歸巢的過程。細胞標記(labeling)和示蹤(tracing)是觀察干細胞體內(nèi)外變化的有效手段。目前常用的示蹤劑包括有機染料、超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxide, SPIO)、量子點(quantum dots, QDs)等等,但是存在著熒光強度衰減、細胞毒性和不穩(wěn)定性等缺點。摻雜鑭系元素的納米顆粒是一種新型生物示蹤材料,與傳統(tǒng)示蹤材料相比,它改善了示蹤靈敏性。本研究應用水熱法合成鋱摻雜納米羥基磷灰石(Terbium doped hydroxyapatite nanoparticles, Tb-nHA)標記示蹤人脂肪來源干細胞(human adipose-derived stem cells, hADSCs),觀察對其增殖分化影響,評價標記示蹤效能,為干細胞體內(nèi)外研究提供一種新的標記示蹤手段。研究目的：1.探索Tb-nHA制備方法。2.觀察Tb-nHA對hADSCs生物學影響。3.Tb-nHA標記hADSCs的機制初探。4.評價Tb-nHA標記示蹤hADSCs的效能。研究方法：1.應用磷酸鈉、硬質(zhì)胺、油酸、乙醇、Tb(N03)3和硝酸鈣為原料,應用水熱法合成鋱(Tb)摻雜納米羥基磷灰石。2. Tb-nHA表征檢測：X射線衍射儀檢測結晶程度和物象組成；透射電鏡下觀察其基本形態(tài)、大小和團集情況,熒光顯微鏡觀察熒光性質(zhì)。3.利用膠原酶消化法分離、培養(yǎng)hADSCs,并進行成骨和成脂誘導分化,應用組織化學染色、流式細胞分析鑒定其干細胞特性。4.不同濃度的Tb-nHA標記hADSCs,應用組織化學染色、real-time PCR觀察其對細胞的增殖分化的影響。5.應用共聚焦顯微鏡觀察經(jīng)Tb-nHA標記后不同代次的hADSCs的熒光強度變化,并應用透射電鏡和共同區(qū)域化方法探討標記機制。6.將Tb-nHA標記的hADSCs與珊瑚羥基磷灰石(CHA)復合,植入裸鼠皮下,術后3M和6M取材,熒光顯微鏡下觀察熒光變化。研究結果：1.水熱法合成的Tb-nHA形態(tài)均一,電鏡下觀察呈棒狀,平均直徑為13.05±1.34nm,平均長度為173.56±23.84nm。2. Tb-nHA在265nm激發(fā)光激發(fā)下呈綠色熒光,發(fā)射波長為544nm,X射線衍射和傅立葉變換紅外線光譜儀分析結果提示Tb-nHA為符合HA晶體結構。3.人脂肪組織經(jīng)膠原酶消化培養(yǎng)出的貼壁生長的梭形細胞具有間充質(zhì)干細胞生物學特點。4.應用含有50 μg/ml、100μg/ml和200 μg/ml Tb-nHA的基礎培養(yǎng)基對hADSCs進行培養(yǎng),MTT檢測提示不影響其細胞增殖,流式細胞分析提示不改變其間充質(zhì)干細胞的表面標記,免疫組織化學染色提示不影響其成骨、成脂分化,real-timePCR檢測成骨誘導培養(yǎng)后第7天、第14天和第21天相關基因表達不受影響。5.共同區(qū)域化溶酶體膜相關蛋白1 (LAMP-1)的免疫熒光染色提示發(fā)綠色熒光的Tb-nHA與發(fā)紅色熒光的LAMP-1重合;透射電子顯微鏡觀察到Tb-nHA標記的細胞內(nèi)大量吞噬體,其中可見棒狀納米材料。共聚焦顯微鏡觀察標記了Tb-nHA的hADSCs經(jīng)過十余代次后,熒光雖然有所減弱,但熒光強度無統(tǒng)計學差異。6.Tb-nHA標記hADSCs與珊瑚羥基磷灰石(CHA)復合材料在裸鼠體內(nèi)3個月和6個月后,熒光顯微鏡下觀察可見發(fā)綠色熒光的細胞,其熒光強度無明顯衰減,免疫組織化學染色提示Tb-nHA所示蹤的細胞為hADSCs.結論：1.水熱法合成的Tb-nHA具有納米級形態(tài)特點,符合HA晶體結構,在265nm激發(fā)光激發(fā)下可以發(fā)出綠色熒光。2.膠原酶消化法可以分離獲得具有間充質(zhì)干細胞特性的hADSCs,Tb-nHA不會影響hADSCs增殖分化能力。3.Tb-nHA標記hADSCs是通過細胞的胞吞作用完成的,主要位于胞內(nèi)的溶酶體內(nèi)。4. Tb-nHA標記hADSCs具有熒光強度衰減緩慢的特點,不論體外標記,還是體內(nèi)示蹤,其效能優(yōu)于傳統(tǒng)有機染料,可以用于干細胞的長期示蹤。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of Tb - nHA on human adipose - derived stem cells ( hADSCs ) and to evaluate the effect of Tb - nHA on human adipose - derived stem cells ( hADSCs ) . Tb - nHA characterization detection : the X - ray diffraction instrument detects the crystallization degree and the image composition ;
The changes of fluorescence intensity of hADSCs after Tb - nHA labeling were observed under electron microscope . The results were as follows : 1 . The Tb - nHA - labeled hADSCs were synthesized by histochemical staining and flow cytometry . The results showed that the Tb - nHA - labeled hADSCs were rod - shaped , the average diameter was 13.05 鹵 1.34nm , and the average length was 173.56 鹵 23.84nm . The fluorescence intensity of Tb - nHA - labeled hADSCs and coral hydroxyapatite ( CHA ) in nude mice showed no influence on the proliferation and differentiation of hADSCs . The Tb - nHA - labeled hADSCs have the characteristics of slow fluorescence intensity attenuation , whether in vitro labeling or in vivo tracing , the efficacy of the Tb - nHA - labeled hADSCs is superior to that of the traditional organic dyes , and can be used for long - term tracing of stem cells .
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R318.08

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本文編號：2099893