本文選題：去細胞 + 腎臟支架��； 參考：《遵義醫(yī)學院》2017年碩士論文

【摘要】：目的:通過灌注法制備戊二醛、肝素交聯(lián)改性去細胞全腎支架,以提升去細胞腎支架的降解時間、生物力學性能及抗凝等指標,以更接近臨床需要。方法:1.實驗分組SD大鼠160只,隨機分為4組,每組40只,第一組(D組):去細胞腎支架;第二組(G組):去細胞腎臟支架交聯(lián)戊二醛;第三組(H組):去細胞腎臟支架交聯(lián)肝素;第四組(G+H組):去細胞腎臟支架交聯(lián)戊二醛后再交聯(lián)肝素。2.制備各組去細胞腎臟支架SD大鼠腹主動脈行留置針置管,經(jīng)下方腹主動脈置入2號留置針并固定,剪破上、下腔靜脈促使血液盡快流出,連接蠕動泵,各組腎臟相應被依次灌入0.01%肝素溶液、1%Triton X-100、0.8%十二烷基硫酸鈉(SDS)、去離子水,0.625%戊二醛(GA)、0.002%肝素鈉溶液及含有雙抗(青霉素-鏈霉素)的去離子水,各組獲得去細胞腎臟均浸泡于生理鹽水4℃冰箱存儲備用。3.病理學觀察(1)大體觀察腎臟外形及顏色差異變化;(2)HE染色、masson染色及掃描電鏡觀察各組去細胞腎臟組織膠原形態(tài)微結(jié)構(gòu);4.生物力學結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性觀察(1)通過體外降解率、吸水率對支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)進行穩(wěn)定性評估(2)通過生物力學檢測,包括:極限抗張強度(Mpa)、斷裂伸長率(%)及彈性模量5.抗凝性觀察(1)甲苯胺藍染色觀察去細胞腎支架是否成功交聯(lián)肝素;(2)血小板黏附試驗將各組去細胞腎支架切取成0.5cmx0.3cm大小組織塊,放入富血小板血漿內(nèi)震蕩6h,取出后依次通過去離子水浸泡、0.5%戊二醛固定、梯度脫水、干燥、鍍金,最后在電子掃描電鏡觀察樣本采集圖像。6.組織相容性檢測大鼠背部正中線兩側(cè)取1cm大小切口切開分離至皮下深筋膜層構(gòu)建四個囊袋,分別植入四組標本(1/4單腎),于3D,1W,2W,4W,8W取出皮下植入支架組織,行HE染色觀察支架內(nèi)部炎癥反應及血管生成情況;7.細胞相容性(1)CCk-8細胞增殖-毒性檢測第一步:制作標準曲線細胞計數(shù)板計數(shù)所制備細胞懸液中的細胞數(shù)量,將該細胞懸液等比稀釋成3-5個細胞濃度梯度(每組做4個復孔)接種于96孔板,37℃5%CO2培養(yǎng)箱孵育2h見細胞貼壁,加入cck-8(10ul)培養(yǎng)2h,酶標儀測定450nm吸光度(OD值),制作標準曲線,其中,X軸:細胞數(shù)量;Y軸:OD值。第二步:樣本的測定及檢測各組腎支架行冰凍切片(厚10um)貼附于六孔板爬片備用,血管內(nèi)皮細胞計數(shù)后(平均7-10×104/ml)制成細胞懸液,分別接種于備用爬片及空白爬片并置入37℃5%CO2培養(yǎng)箱孵育7D,5D,3D,2D,1D,每孔加入200ul cck-8溶液,置入培養(yǎng)箱孵育2h,移液槍移入96孔板,酶標儀測定450nm吸光度,根據(jù)標準曲線計算細胞存活率、抑制率。(2)免疫熒光染色各組腎支架行冰凍切片(厚10um)貼附于六孔板爬片備用,血管內(nèi)皮細胞計數(shù)后(平均7-10×104/ml)滴于爬片共培養(yǎng),三天后取出行免疫熒光染色觀察,PBS清洗殘余培養(yǎng)基,甲醛固定后,血清封閉,滴加一抗(Collagen IV抗體抗鼠、sma抗體抗兔)置入暗盒于4℃冰箱孵化過夜,次日滴加二抗(755綠光抗鼠,694紅光抗兔)及DAPI復染后熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果:1.大體觀察各組去細胞腎支架保存腎臟原有外形,D組呈半透明白色,稍塌陷,其余三組去細胞腎支架形態(tài)較未交聯(lián)前更立體,交聯(lián)戊二醛后的去細胞腎支架顏色呈淡黃色。2.病理學觀察HE染色及Masson染色觀察可見各組細胞外基質(zhì)(extracellular matrixc,ECM)成分完整,膠原無斷裂,清晰可見明顯類似腎小球、腎小管、血管結(jié)構(gòu)輪廓,纖維及基膜等機構(gòu)連續(xù)完整,腎小球及腎小管內(nèi)均未見細胞殘留結(jié)構(gòu);掃描電鏡清晰可見未交聯(lián)組和交聯(lián)組去細胞腎支架上未見細胞殘留,膠原連續(xù)連接,無斷裂,交聯(lián)組可見支架上附著各對應的藥物顆粒。3.生物力學及組織穩(wěn)定性觀察G+H組及G組腎支架降解率遠低于D組腎支架(P0.05);D組吸水率(94.88%)高于G組(88.14%)及G+H組(88.72%)(P0.05);戊二醛交聯(lián)后提高了腎支架的力學性能,包括:極限抗張強度和彈性模量(P0.05)。4.抗凝性觀察肝素交聯(lián)(H組和G+H組)去細胞腎支架上未見明顯血小板黏附,而未進行肝素交聯(lián)(D組,G組)腎支架布滿血小板。5.組織相容性觀察背部皮下包埋結(jié)果顯示未進行交聯(lián)的腎支架在包埋兩周便開始降解,通過GA交聯(lián)后腎支架包埋4周才出現(xiàn)降解現(xiàn)象,各組包埋腎支架內(nèi)部均可見新生血管。6.細胞相容性觀察CCK-8試驗提示各組的去細胞腎支架和血管內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)后,均未產(chǎn)生細胞毒性,同時與空白組相比較,表現(xiàn)出一定的促細胞增殖作用。各實驗組與對照組去細胞腎支架分別與腎的血管內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)三天后行免疫熒光染色顯示,細胞均能良好的貼附于支架生長,表現(xiàn)出良好的細胞相容性。結(jié)論:1.與單純?nèi)ゼ毎I支架相比較,通過灌注法制備的戊二醛、肝素交聯(lián)的去細胞腎支架具有外形更為立體,更長的體內(nèi)外降解時間、及更穩(wěn)定的生物力學性能;2.相比較于單純?nèi)ゼ毎I支架,肝素交聯(lián)修飾后的去細胞腎支架具備一定的抗凝性能;3.通過戊二醛、肝素交聯(lián)的去細胞腎支架仍能保留去細胞生物腎支架特有的良好組織相容性和細胞相容性。
[Abstract]:Objective : To prepare glutaraldehyde and heparin cross - linked modified acellular renal scaffold by perfusion method . The results were as follows : 1 . There was no obvious platelet adhesion on the renal stents in group D and G + H group . The results were as follows : 1 . There was no obvious platelet adhesion on the kidney support of group D and G + H group . Conclusion : 1 . Compared with the simple acellular kidney stent , the acellular kidney stent crosslinked by heparin has a more stereo , longer in vivo external degradation time and more stable biological mechanical property ; 2 . Compared with the simple acellular kidney bracket , the acellular kidney stent after heparin crosslinking has certain anticoagulation performance ; 3 . The acellular kidney stent crosslinked by heparin can still retain the specific good tissue compatibility and cell compatibility of the acellular biological kidney scaffold .
【學位授予單位】：遵義醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R318.08

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本文編號：2076899