本文選題：檸檬酸骨替代材料生物降解材料粉碎性骨折間充質(zhì)干細(xì)胞 + ��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：背景：骨折是骨外科臨床工作中最常見的疾患。骨質(zhì)疏松、高能量外傷、腫瘤侵蝕是引發(fā)骨折的常見病因。對于簡單骨折及其并發(fā)的小范圍骨缺損而言,在有效復(fù)位和固定條件下,依靠骨組織較強的自我修復(fù)能力即可獲得良好的骨折修復(fù)。然而,對于合并較大骨缺損的復(fù)雜骨折病例而言(如粉碎性開放骨折),單純依靠骨組織的自我修復(fù)能力無法達(dá)到滿意的骨折愈合效果。因此,以促進骨修復(fù)為目標(biāo),研發(fā)新型生物活性骨替代材料成為生物工程領(lǐng)域的重要研究方向。可注射的生物活性骨替代材料具有良好流動性與變形能力,能通過改變自身形態(tài)來修復(fù)骨折及骨缺損,因而被廣泛看好。然而,當(dāng)前已臨床應(yīng)用和尚處于實驗研究階段的可注射骨替代材料均受限于自身不足,不能仿生自然的骨替代生理過程。一方面,臨床廣泛應(yīng)用的聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate, PMMA)惰性骨水泥和磷酸鈣(calcium phosphate cement,CPC)生物活性骨水泥雖然能彌合填充骨折塊間的缺損、穩(wěn)定骨折并提供良好力學(xué)支持,但其緩慢的自降解能力會阻礙骨替代材料被再生骨組織自然替代。另一方面,尚處于實驗研究階段的基于水凝膠的復(fù)合型骨替代材料,雖然具備較快的生物降解性,但與骨界面之間的粘附能力以及自身成骨誘導(dǎo)能力(不復(fù)合骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 (Bone Morphogenetic Protein-2, BMP-2)等骨誘導(dǎo)因子情況下)并不令人滿意。因此,臨床亟需一種新型的可注射自降解骨替代材料,以期能同時具備下述方面的潛能：1)良好骨界面粘附性能,粘合并固定骨塊；2)成骨誘導(dǎo)能力,材料自降解過程中緩釋成骨誘導(dǎo)分子；3)材料快速自降解,促進生血管再生與新生骨替代進程。我們將具有成骨誘導(dǎo)潛能的檸檬酸分子和有較強粘附能力的左旋多巴分子通過化學(xué)反應(yīng)整合入高分子聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)中,研發(fā)出一類新型自降解骨替代材料——生物仿生的基于檸檬酸的可注射生物膠黏劑-羥基磷灰石復(fù)合物(injectable citrate-based mussel-inspired tissue bioadhesive-hydroxyapitite composite, iCMBA/HA composite)。作為復(fù)合物中的重要組分,檸檬酸分子最近被發(fā)現(xiàn)在骨形成與骨礦化過程中有重要調(diào)控作用。Tran等報道檸檬酸能促進成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)和成骨分化轉(zhuǎn)錄因子(osterix, OSX)基因表達(dá)。Hu等發(fā)現(xiàn)檸檬酸可限制骨骼中磷灰石納米晶體的過度增厚和生長,對于維持磷灰石納米晶體結(jié)構(gòu)及其力學(xué)性能發(fā)揮重要作用。Costello等認(rèn)為成骨過程中發(fā)生的“檸檬酸化”過程與成骨細(xì)胞內(nèi)檸檬酸代謝機制改變密切相關(guān),在干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化和骨形成過程中成骨細(xì)胞出現(xiàn)“檸檬酸化”(citration,即檸檬酸在細(xì)胞代謝過程中剩余并大量分泌出細(xì)胞外,隨后沉積于細(xì)胞外基質(zhì))是不可或缺的重要階段。這些發(fā)現(xiàn)提示：檸檬酸在骨形成與骨誘導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用,并應(yīng)該納入骨替代物的設(shè)計。左旋多巴分子是復(fù)合物中的另一重要組分。作為生物粘合劑,左旋多巴分子最初提取自水生蚌殼類動物的分泌液。分泌的左旋多巴使得水生蚌殼類動物能在濕潤界面上牢固的附著。它的這一特質(zhì)給予我們靈感,促使我們將其化合入iCMBA聚合物結(jié)構(gòu)中以增強材料的粘附強度。在本項研究中,圍繞新型生物仿生的可注射生物膠黏劑-羥基磷灰石復(fù)合物(iCMBA/HA),我們進行系統(tǒng)的材料學(xué)表征、體外細(xì)胞學(xué)測試和體內(nèi)動物學(xué)研究,驗證其相關(guān)潛能并探討可能的分子學(xué)機制,為后期臨床試驗提供堅實的實驗室證據(jù)。目的：1)對iCMBA預(yù)聚物和iCMBA/HA復(fù)合物進行固化時間、理化性質(zhì)、力學(xué)性能以及體外礦化能力等方面的表征；2)通過體外細(xì)胞培養(yǎng)測試iCMBA/HA復(fù)合物的細(xì)胞相容性以及降解產(chǎn)物在成骨細(xì)胞增殖、分化方面的調(diào)控作用；3)在體內(nèi)動物粉碎性骨折模型中測試iCMBA/HA復(fù)合物作為修復(fù)骨折的粘合性骨替代材料在新骨形成與骨結(jié)構(gòu)重建中的作用；4)初步探討檸檬酸(降解產(chǎn)物中的重要組分)在成骨細(xì)胞增殖與分化過程中的調(diào)節(jié)作用。方法：應(yīng)用核磁共振氫譜、紅外光譜、高分子聚合物理化降解實驗和力學(xué)測試實驗分別對iCMBA預(yù)聚合物和iCMBA/HA復(fù)合物進行化學(xué)基團、理化特性、力學(xué)性能以及體外礦化能力方面的表征,遴選出合適的iCMBA/HA復(fù)合物配方；通過體外細(xì)胞培養(yǎng),利用噻唑藍(lán)MTT細(xì)胞增殖實驗和Live/Dead細(xì)胞活性實驗分別測試iCMBA/HA降解產(chǎn)物對間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞增殖與活性的影響,同時采用Western Blot免疫印跡和Elisa技術(shù)檢測iCMBA/HA降解產(chǎn)物對成骨細(xì)胞骨相關(guān)標(biāo)志蛋白(成骨分化轉(zhuǎn)錄因子Runx2、堿性磷酸酶ALP和骨鈣素OCN)表達(dá)的調(diào)控作用；在新西蘭大白兔橈骨粉碎性模型上測試iCMBA/HA修復(fù)骨折過程中對骨量、骨質(zhì)強度和骨結(jié)構(gòu)重建的作用：最后在細(xì)胞層面初步探討iCMBA/HA重要降解產(chǎn)物,檸檬酸,對成骨細(xì)胞分化標(biāo)志蛋白(Runx2和OCN)表達(dá)以及成骨細(xì)胞礦化功能的的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果：1預(yù)聚物和復(fù)合物的表征A)化學(xué)基團表征：核磁共振氫譜圖(1H-NMR)在6.7 ppm (a)區(qū)域出現(xiàn)低幅多峰值提示：多巴胺(Dopamine)成功鍵合進入預(yù)聚物的側(cè)鏈基團,同時在傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectra, FTIR)結(jié)果中得到印證。B)固化時間表征：各組iCMBA/HA復(fù)合物的固化時間在159±8秒至247±13秒之間。隨著羥基磷灰石(HA)比率的增加,復(fù)合物固化時間降低。而增加高碘酸鈉(PI)的濃度可加速交聯(lián)過程,縮短固化時間。C)理化性能表征：各組iCMBA/HA復(fù)合物的溶出物含量均較低,約為3%。iCMBA/HA70%(iCH70)復(fù)合物的溶脹比僅為110%,顯著低于其他iCMBA/HA復(fù)合物(P均0.05)。在降解速度方面,iCH70復(fù)合物約30天可完全降解。D)力學(xué)性能表征：隨著羥基磷灰石(HA)含量的增加,iCMBA/HA復(fù)合物的抗壓縮強度及楊氏模量逐漸增加。當(dāng)羥基磷灰石含量增至70%時,新鮮制備2小時的iCH70的抗壓縮強度可達(dá)1.554±0.152 MPa,并且隨著時間延長(制備后24,48小時),可分別增至2.592±0.253MPa和3.182±0.272MPa,高于iCH30和iCH50組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p均0.05)。E)體外礦化表征：體外孵育1天,iCH70復(fù)合物樣本表面未見鈣沉積晶體形成。隨孵育時間延長,磷酸鈣晶體形成并逐漸生長,至孵育第5天可見明顯晶體層。經(jīng)X射線光電子能量色散譜(EDX)檢測證實為磷酸鈣晶體,量化Ca/P比率約為1.61。而未復(fù)合羥基磷灰石的純iCMBA表面始終未見類似晶體形成。F)檸檬酸累積釋放濃度表征：降解第2天,iCH70降解溶液中檸檬酸濃度已達(dá)200uM。隨著時間延長,檸檬酸累積釋放濃持續(xù)升高,第6天升至900uM,第10至22天進入平臺期,檸檬酸釋放濃度約1200uM。2體外細(xì)胞實驗A) hMSC細(xì)胞相容性測試：各組iCMBA/HA溶出物溶液中hMSC的細(xì)胞活性處于72.510±3.374%與84.302±7.014%之間,溶出物溶液的hMSC細(xì)胞相容性好。隨著溶出物溶液成倍稀釋,hMSC細(xì)胞活性可繼續(xù)攀升達(dá)90%以上。各組iCMBA/HA復(fù)合物的降解產(chǎn)物溶液中的hMSC細(xì)胞活性均高于PLGA降解溶液,70.846+5.162%。其細(xì)胞相容性優(yōu)于被廣泛應(yīng)用并認(rèn)可的PLGA.隨著降解產(chǎn)物溶液成倍稀釋,hMSC細(xì)胞活性可達(dá)95%以上。B)成骨細(xì)胞活性測試：iCH70降解產(chǎn)物溶液中,成骨細(xì)胞活性好,未見明顯凋亡或死亡細(xì)胞。成骨細(xì)胞數(shù)量隨時間延長持續(xù)增加。成骨細(xì)胞形態(tài)與hMSC細(xì)胞形態(tài)差異化逐漸明顯,并出現(xiàn)聚集趨勢。C)成骨分化蛋白水平檢測：iCH70降解溶液中,分化早期的成骨細(xì)胞內(nèi)成骨細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄因子(Runx2)表達(dá)水平上調(diào),分化中后期的堿性磷酸酶(ALP)活性增加,分化后期的骨鈣素(OCN)蛋白水平下調(diào)。D)成骨礦化檢測：隨著時間推移,iCH70降解溶液中成骨細(xì)胞外基質(zhì)鈣結(jié)節(jié)的數(shù)量逐漸增加,分化第14天鈣結(jié)節(jié)數(shù)量最多。3體內(nèi)動物實驗A) Micro CT骨量量化分析：術(shù)后當(dāng)日,iCH70組與空白對照組的局部骨礦總量(BMC)和骨密度(BMD)值無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P均0.05)。術(shù)后4,8,12周,與空白對照組相比,iCH70組的局部骨礦總量(BMC)和骨密度(BMD)分別為387.167±9.827 mg和122.000±5.586 mg/cm3,417.000±21.043 mg和133.00±6.325 mg/cm3,427.000±17.413 mg和143.00±8.579 mg/cm3.但僅在術(shù)后4,8周,iCH70組的骨密度值與對照組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均0.05)。B)三點彎曲力學(xué)測試：術(shù)后4,8,12周,iCH70組橈骨愈合區(qū)的最大抗彎負(fù)載強度分別達(dá)到128.000±3.688,146.000±3.521,178.500±4.848N,均高于空白對照組,組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均0.05)。C)骨組織形態(tài)學(xué)染色分析：iCH70修復(fù)橈骨骨折過程中,iCH70復(fù)合物降解速度較快,30天幾乎完全體內(nèi)降解。骨愈合區(qū)內(nèi),有多量新生血管形成,未降解的HA顆粒逐漸納入新生骨組織中。術(shù)后12周可見HA顆粒幾乎完全被吸收進入新生骨組織,新生骨結(jié)構(gòu)較空白對照組更為緊密厚實。4初步探討檸檬酸對成骨增殖分化的調(diào)節(jié)作用A) hMSC細(xì)胞增殖的檸檬酸濃度安全窗測試：低濃度檸檬酸(20gM-2000μM)對hMSC的增殖無抑制作用；高濃度檸檬酸(10000μM至20000μM范圍)對hMSC的增殖有抑制作用。hMSC增殖的檸檬酸濃度控制2000μM以下較為安全。B)檸檬酸調(diào)控成骨分化功能：檸檬酸(200μM)在成骨分化早期能上調(diào)Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 (Runx2)的表達(dá)水平,而在成骨分化的后期,抑制成骨細(xì)胞內(nèi)的骨鈣素(OCN)表達(dá)。C)檸檬酸調(diào)控成骨礦化功能：檸檬酸(200μM)能促進成骨分化后期細(xì)胞外基質(zhì)中鈣結(jié)節(jié)的形成。結(jié)論：基于檸檬酸的可注射自降解生物粘附性材料-羥基磷灰石復(fù)合物(iCMBA/HA)具有良好的可操作性、合理的降解速率和力學(xué)支撐強度,與hMSC細(xì)胞相容性好,能促進成骨細(xì)胞的體外分化與礦化,促進骨折區(qū)骨量增加和骨力學(xué)強度恢復(fù),是良好的可注射生物降解活性骨替代物,可用于粉碎性骨折等復(fù)雜骨折與骨缺損的修復(fù)治療。檸檬酸,作為復(fù)合物中的最重要的降解產(chǎn)物,在成骨細(xì)胞增殖分化與礦化過程中起重要調(diào)控作用。
[Abstract]:Background : Fracture is one of the most common diseases in the clinical work of bone surgery . Bone loss , high energy trauma , and tumor erosion are the common causes of fracture .
2 ) osteogenic induction capability , and the material is slowly released into bone inducing molecules during self - degradation ;
3 ) The rapid self - degradation of the materials promotes the regeneration of raw blood vessels and the replacement of the new bone . We have developed a new type of biodegradable injectable bioadhesive - hydroxyapitite composite ( iCMBA / HA composite ) based on citric acid , which is a new type of self - degradable bone substitute material , biosimilar , into the chemical structure of the polymer polymer through chemical reaction . As an important component of complex , citric acid molecule has recently been found to play an important role in bone formation and bone mineralization . It has been found that citric acid plays an important role in promoting osteoblast alkaline phosphatase ( ALP ) and osterix , OSX gene expression .
2 ) the cell compatibility of the iCMBA / HA composite and the regulation effect of the degradation products on the proliferation and differentiation of osteoblasts are tested through in vitro cell culture ;
3 ) the role of iCMBA / HA complex in the reconstruction of new bone formation and bone structure is tested by testing iCMBA / HA composite in animal comminuted fracture model in vivo ;
4 ) The effects of citric acid ( important components in degradation products ) on proliferation and differentiation of osteoblasts were investigated .
The effects of iCMBA / HA degradation products on the proliferation and activity of mesenchymal stem cells and osteoblasts were tested by MTT cell proliferation experiment and Live / Dead cell activity experiment . Western Blot and ELISA were used to detect the expression of bone - related marker protein ( osteogenic differentiation transcription factor Runx2 , alkaline phosphatase ALP and bone calcium OCN ) .
The effect of iCMBA / HA complex on bone mass , bone strength and bone structure remodeling was studied in this paper . The results showed that the concentration of iCMBA / HA composite was lower than that of other iCMBA / HA complexes . Bone mineral density ( BMC ) and bone mineral density ( BMD ) of iCH70 group were significantly higher than those in control group ( P < 0.05 ) .
Conclusion : citric acid ( 200 渭M ) can increase the expression level of Runt - related transcription factor 2 ( Runx2 ) at the early stage of osteogenic differentiation .

【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R683;R318.08

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本文編號：1888645