本文選題：骨膜來(lái)源干細(xì)胞 + PDGF-bb��； 參考：《浙江大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：前言： 前交叉韌帶(ACL)損傷后往往出現(xiàn)關(guān)節(jié)穩(wěn)定性差,引起膝關(guān)節(jié)反復(fù)損傷,這樣會(huì)加快關(guān)節(jié)軟骨逐步退化。膝關(guān)節(jié)交叉韌帶重建術(shù)后的腱骨愈合是一個(gè)非常復(fù)雜和漫長(zhǎng)的過程,長(zhǎng)期以來(lái)一直是運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域治療的熱點(diǎn)、難點(diǎn)問題。目前所有針對(duì)交叉韌帶重建術(shù)后促進(jìn)腱骨愈合的方法很多,但遠(yuǎn)期療效均不是十分理想,在這種情況下,作為一種可選擇性的替代療法,以干細(xì)胞為核心的組織工程方法為促進(jìn)腱骨愈合提供了新的方法。通常組織工程方法促進(jìn)隧道內(nèi)的腱骨愈合需要具備以下三個(gè)條件：首先組織來(lái)源的干細(xì)胞數(shù)量必須充足,生物功能正常,具有向成骨分化能力的種子干細(xì)胞；其次需要具備良好生物相容性,可以細(xì)胞無(wú)毒性降解、孔隙直徑和孔隙率適合的三維生物支架；最后需要包含有調(diào)節(jié)種子干細(xì)胞增殖、分化并能維持干細(xì)胞表型特征的細(xì)胞生長(zhǎng)因子。 骨膜來(lái)源干細(xì)胞(Periosteum-Dirved Stem Cells, PDSCs)是來(lái)自骨膜內(nèi)層的成體干細(xì)胞,由于其比其他成體干細(xì)胞來(lái)源充足,取材方便,而且在體外培養(yǎng)的條件下骨膜來(lái)源干細(xì)胞具有很強(qiáng)的傳代增殖和穩(wěn)定的定向分化能力。PDSCs與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone-marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)具有相似的生物學(xué)特征和分化潛能,但較BMSCs具有更強(qiáng)的成骨分化能力,植入體內(nèi)后能很好地適應(yīng)受區(qū)環(huán)境,并保持良好的成骨活性,最終通過軟骨化骨修復(fù)骨缺損。現(xiàn)研究證明：骨膜來(lái)源干細(xì)胞已經(jīng)成為理想的種子細(xì)胞來(lái)源,是當(dāng)前骨科臨床基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)。最近出現(xiàn)的可注射性水凝膠支架羥基苯丙酸凝膠(Gelatin-Hpa),它凝固的硬度和速度不受聚合物前體濃度的影響,交聯(lián)酶(HRP)和氧化劑(H202)的濃度可以分別控制水凝膠的交聯(lián)速度和程度。目前該可注射性水凝膠已經(jīng)成為組織工程領(lǐng)域應(yīng)用中的新興支架材料。 血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)是由多種細(xì)胞產(chǎn)生的重要多肽生長(zhǎng)因子,它是多種細(xì)胞的有絲分裂刺激原,對(duì)間充質(zhì)于細(xì)胞,成骨細(xì)胞,成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等均具有趨化作用,是趨化作用最強(qiáng)的骨生長(zhǎng)因子。而PDGF-bb是在骨科基礎(chǔ)與臨床研究領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的變異體之一。PDGF-bb能促進(jìn)成骨細(xì)胞DNA合成,細(xì)胞復(fù)制,膠原及非膠原蛋白的合成；PDGF-bb能促進(jìn)血管內(nèi)皮的增殖,誘導(dǎo)VEGF mRN A的表達(dá),能夠促進(jìn)損傷局部血液循環(huán)的重建；對(duì)BMP-2研究已經(jīng)很深入,它是一種能夠啟動(dòng)成骨分化,并作用與整個(gè)成骨過程的細(xì)胞因子,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于骨組織工程中。 雖然研究已經(jīng)表明PDSCs具有修復(fù)骨缺損的作用,但應(yīng)用非誘導(dǎo)的PDSCs進(jìn)行骨缺損修復(fù)的研究不夠明確；同時(shí)由于骨膜來(lái)源干細(xì)胞初始數(shù)量不足,需要強(qiáng)有力的細(xì)胞刺激因子來(lái)促進(jìn)細(xì)胞的增殖和成骨分化；基于PDGF-bb和BMP-2各自獨(dú)特的生理作用,本實(shí)驗(yàn)擬應(yīng)用PDGF-bb聯(lián)合BMP-2共同作用于骨膜來(lái)源干細(xì)胞；目前尚沒有應(yīng)用PDGF-bb聯(lián)合BMP-2對(duì)骨膜來(lái)源干細(xì)胞在二維培養(yǎng)和可注射性水凝膠Gelatin-Hpa中增殖及成骨分化能力影響的研究；待完成本實(shí)驗(yàn)后,期待在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中通過簡(jiǎn)單的注射添加有雙重生長(zhǎng)因子PDGF-bb和BMP-2以及骨膜來(lái)源干細(xì)胞的可注射性水凝膠Gelatin-Hpa促進(jìn)局部隧道內(nèi)腱骨愈合,最終應(yīng)用于臨床實(shí)踐。骨膜來(lái)源干細(xì)胞應(yīng)用到局部來(lái)促進(jìn)腱骨愈合有以下幾個(gè)問題：(1)目前沒有明確的定義來(lái)明確骨膜細(xì)胞,更確切的表達(dá)應(yīng)該是骨膜來(lái)源干細(xì)胞,其各向分化潛能及有效率目前還在進(jìn)一步研究之中,(2)由于骨膜來(lái)源干細(xì)胞只存在骨膜的最里層,含量比較少,需要有一定內(nèi)外刺激骨膜細(xì)胞的增生,同時(shí)能促進(jìn)其向成骨方向分化。(3)骨膜來(lái)源干細(xì)胞應(yīng)用到損傷局部需要一定的載體,它能給骨膜來(lái)源干細(xì)胞的增殖、成骨分化提供一個(gè)良好微環(huán)境。 針對(duì)以上骨膜來(lái)源干細(xì)胞在骨科臨床基礎(chǔ)研究中遇到的問題本實(shí)驗(yàn)分成三個(gè)部分：(1)骨膜來(lái)源干細(xì)胞的分離,二維培養(yǎng)與功能鑒定：取小型豬股骨骨膜,常規(guī)原代細(xì)胞分離培養(yǎng),選用STRO-1作為標(biāo)志物,根據(jù)間接免疫磁珠正選法純化骨膜來(lái)源干細(xì)胞,相差顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)以及普通擴(kuò)增培養(yǎng)基下的細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線；然后分別取不同代的骨膜來(lái)源干細(xì)胞(P3、P5、P7)在成骨培養(yǎng)基的誘導(dǎo)下觀察ALP活性、鈣鹽沉積以及相關(guān)成骨基因如ALP, Runx-2, Col-I, OCN基因表達(dá)的水平,結(jié)果顯示P3、P5、P7骨膜來(lái)源干細(xì)胞具有良好的成骨分化能力,但是隨著傳代次數(shù)的增加,成骨分化能力也相應(yīng)的減弱,P7各項(xiàng)成骨分化能力指標(biāo)明顯弱于P3(P0.05)。(2)檢測(cè)單獨(dú)PDGF-bb或者聯(lián)合BMP-2在體外對(duì)骨膜來(lái)源干細(xì)胞的增殖以及成骨分化能力的影響；通過MTT法檢測(cè)不同濃度PDGF-bb對(duì)骨膜來(lái)源干細(xì)胞增殖能力的影響,結(jié)果顯示隨著PDGF-bb濃度的提高,其對(duì)骨膜來(lái)源干細(xì)胞增殖促進(jìn)作用也增強(qiáng),以50ng/ml最為明顯,然而隨著PDGF-bb濃度進(jìn)一步提高,其對(duì)PDSCs的增殖作用相應(yīng)的減弱,但不同濃度之間對(duì)PDSCs的增殖影響沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。然后分別比較不同實(shí)驗(yàn)組之間OM,OM+PDGF-bb、OM+BMP-2、OM+BMP-2+PDGF-bb的成骨分化能力,采用RT-PCR和von-Kossa礦物質(zhì)沉積染色,結(jié)果顯示：與單獨(dú)PDGF-bb或BMP-2作用于骨膜來(lái)源干細(xì)胞相比, PDGF-bb聯(lián)合BMP-2對(duì)細(xì)胞的增殖作用沒有顯著性差異(P0.05)；PDGF-bb對(duì)BMP-2生長(zhǎng)因子在二維培養(yǎng)的情況下對(duì)骨膜來(lái)源干細(xì)胞的成骨分化具有抑制作用。(3)在前兩部分的基礎(chǔ)上,選用骨膜來(lái)源干細(xì)胞為種子細(xì)胞,選用Gelatin-Hpa為水凝膠支架,單獨(dú)添加PDGF-bb或添加雙重生長(zhǎng)因子PDGF-bb和BMP-2,然后檢測(cè)骨膜來(lái)源干細(xì)胞在可注射性水凝膠中的生物相容性以及增殖和成骨分化能力,結(jié)果顯示骨膜來(lái)源干細(xì)胞在Gelatin-Hpa生物相容性良好,同時(shí)發(fā)現(xiàn)PDGF-bb聯(lián)合BMP-2生長(zhǎng)因子在可注射性水凝膠三維培養(yǎng)環(huán)境中在促進(jìn)成骨分化方向上具有協(xié)同作用。 第一部分：骨膜來(lái)源干細(xì)胞(PDSCs)的分離、培養(yǎng)與鑒定 目的：分離和純化小型豬骨膜來(lái)源干細(xì)胞,同時(shí)檢測(cè)不同代(P3、P5、P7)骨膜來(lái)源干細(xì)胞之間的增殖和成骨分化能力的區(qū)別。 方法：從小型豬股骨取下骨膜塊組織從50ml的試管中取出,剪碎并用相應(yīng)的酶消化,常規(guī)原代細(xì)胞培養(yǎng),對(duì)骨膜來(lái)源干細(xì)胞進(jìn)行SP免疫組織化學(xué)染色,然后選用STRO-1作為標(biāo)志物,根據(jù)間接免疫磁珠正選法純化骨膜來(lái)源干細(xì)胞；分別取不同代的骨膜來(lái)源干細(xì)胞(P3、P5、P7)在成骨培養(yǎng)基的誘導(dǎo)下觀察ALP活性、鈣鹽沉積情況以及相關(guān)成骨基因如LP、Runx-2、Col-I、OCN基因表達(dá)情況。結(jié)果：培養(yǎng)3-4天后細(xì)胞的形態(tài)為多變,有梭形,三角形或多角形；普通擴(kuò)增培養(yǎng)基下的骨膜來(lái)源干細(xì)胞呈現(xiàn)典型的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；骨膜來(lái)源干細(xì)胞抗STRO-1染色陽(yáng)性；P3、P5、P7骨膜來(lái)源干細(xì)胞具有良好的成骨分化能力,但是隨著傳代的次數(shù)的增加,成骨分化能力也相應(yīng)的減弱,P7各項(xiàng)成骨分化能力指標(biāo)如ALP活性、鈣鹽沉積情況以及相關(guān)成骨基因如ALP、Runx-2、Col-I、OCN基因表達(dá)情況等明顯弱于P3(P0.05)。 結(jié)論：骨膜細(xì)胞因?yàn)槠浔容^強(qiáng)的成骨能力及相對(duì)簡(jiǎn)單的培養(yǎng)、誘導(dǎo)條件,使其目前成為骨組織工程實(shí)驗(yàn)室研究很有潛力的種子細(xì)胞；STRO-1作為標(biāo)志物,根據(jù)間接免疫磁珠正選法純化骨膜來(lái)源干細(xì)胞是一種有效的原代細(xì)胞純化方法；考慮到骨膜來(lái)源干細(xì)胞隨著傳代次數(shù)的增加,其成骨分化能力會(huì)相應(yīng)的減弱,所以在骨組織工程應(yīng)用中盡量選擇P5之前的骨膜來(lái)源干細(xì)胞。 第二部分單獨(dú)PDGF-bb或者聯(lián)合BMP-2對(duì)骨膜來(lái)源干細(xì)胞的增殖、成骨分化能力的影響 目的：檢測(cè)單獨(dú)PDGF-bb或者聯(lián)合BMP-2在二維培養(yǎng)環(huán)境下對(duì)骨膜來(lái)源干細(xì)胞的增殖、成骨分化能力的影響。 方法：將濃度分別為10、20、50.100.150ng/ml的PDGF-bb加入96孔培養(yǎng)板中,采用MTT法,檢測(cè)不同濃度PDGF-bb對(duì)骨膜來(lái)源干細(xì)胞增殖能力的影響；然后選取P3骨膜來(lái)源干細(xì)胞,采用RT-PCR和von-Kossa染色法,檢測(cè)PDSCs在含有不同生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基中(OM、OM+PDGF-bb、OM+BMP-2OM+BMP-2+PDGF-bb)成骨分化能力。 結(jié)果：隨著PDGF-bb濃度的提高,其對(duì)骨膜來(lái)源干細(xì)胞增殖促進(jìn)作用也相應(yīng)的增強(qiáng),以50ng/ml最為明顯,然而隨著PDGF-bb濃度進(jìn)一步提高,其對(duì)PDSCs的增殖作用相應(yīng)的減弱,但不同濃度之間對(duì)PDSCs的增殖影響沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。然后分別比較不同實(shí)驗(yàn)組之間OM、OM+PDGF-bb、OM+BMP-2、 M+BMP-2+PDGF-bb的成骨分化能力比較,采用RT為-PC R和von-Kossa礦物質(zhì)沉積染色,與生長(zhǎng)因子PDGF-Bb或BMP-2作用于骨膜來(lái)源干細(xì)胞相比,PDGF-bb聯(lián)合BMP-2生長(zhǎng)因子對(duì)細(xì)胞的增殖作用沒有顯著性差異。PDGF_bb對(duì)BMP-2生長(zhǎng)因子在二維培養(yǎng)的情況下對(duì)骨膜來(lái)源干細(xì)胞的成骨分化具有抑制作用。 結(jié)論：PDGF-bb對(duì)于骨膜來(lái)源干細(xì)胞的增殖具有很強(qiáng)的促進(jìn)作用,且呈現(xiàn)濃度依賴型,其中以濃度50ng/ml達(dá)到高峰,但是隨著濃度PDGF-b b繼續(xù)增加,促進(jìn)細(xì)胞增殖作用開始下降。與生長(zhǎng)因子PDGF-bb或BMP-2作用于骨膜來(lái)源干細(xì)胞相比,PDGF-bb聯(lián)合BMP-2生長(zhǎng)因子對(duì)細(xì)胞的增殖作用沒有顯著性差異。PDGF-bb對(duì)BMP-2生長(zhǎng)因子在二維培養(yǎng)的情況下對(duì)骨膜來(lái)源干細(xì)胞的成骨分化具有抑制作用。 第三部分：載PDGF-bb和BMP-2的可注射性水凝膠Gelatin-Hpa對(duì)骨膜來(lái)源干細(xì)胞增殖及成骨分化能力的影響 目的：檢測(cè)骨膜來(lái)源干細(xì)胞與可注射性水凝膠Gelatin-Hpa的生物相容性以及載PDGF-bb和BMP-2的可注射性水凝膠Gelatin-Hpa對(duì)骨膜來(lái)源干細(xì)胞增殖及成骨分化能力的影響。 方法：首先檢測(cè)Gelatin-Hpa的流變性能以及體外降解性能,然后觀察骨膜來(lái)源干細(xì)胞種植在可注射性水凝膠Gelatin-Hpa的存活率以及粘附率；同時(shí)觀察骨膜來(lái)源干細(xì)胞在不同濃度H202的氧化刺激下的表現(xiàn)；最后采用采用RT-PCR和von-Kossa染色法檢測(cè)骨膜來(lái)源干細(xì)胞在含有不同生長(zhǎng)因子(OM、OM+PDGF-bb. OM+BMP-2、OM+BMP-2+PDGF-bb)的成骨培養(yǎng)基誘導(dǎo)下的成骨分化相關(guān)基因(ALP、Runx-2、Col-1、OCN)的表達(dá)水平以及礦鹽沉積情況。 結(jié)果：骨膜來(lái)源干細(xì)胞在可注射性水凝膠Gelatin-Hpa具有良好的相容性,細(xì)胞存活率90%,細(xì)胞粘附率80%；骨膜來(lái)源干細(xì)胞在可注射性水凝膠Gelatin-Hpa具有高度耐受氧化的能力,骨膜來(lái)源干細(xì)胞包埋在Gelatin-Hpa中24小時(shí)后給予H202氧化應(yīng)激,同時(shí)膠原作為對(duì)照組采用相同的方式。結(jié)果顯示包埋在膠原中的骨膜來(lái)源干細(xì)胞更容易受到H202的氧化應(yīng)激,出現(xiàn)大量的細(xì)胞死亡,尤其在H202比較高的時(shí)候。相反,在Gelatin-Hpa中的骨膜來(lái)源干細(xì)胞存活情況則基本不受H202氧化應(yīng)激的影響。早期成骨分化的基因Col-I、ALP在第7天和14天的mRNA表達(dá)水平在OM+BMP-2+PDGF-bb組明顯高于其他實(shí)驗(yàn)組,尤其是OM+BMP-2+PDGF-bb與OM+BMP-2存在顯著性差異(P0.01),提示PDGF-bb在促進(jìn)骨膜來(lái)源干細(xì)胞增生的同時(shí),與BMP-2誘導(dǎo)骨膜細(xì)胞向成骨方向分化存在協(xié)同作用；這個(gè)趨勢(shì)同樣在晚期成骨標(biāo)志OCN得到體現(xiàn)；這點(diǎn)與骨膜來(lái)源干細(xì)胞在二維培養(yǎng)中的成骨分化能力表現(xiàn)有所不同。 結(jié)論：結(jié)果顯示骨膜來(lái)源干細(xì)胞在Gelatin-Hpa生物相容性良好,同時(shí)發(fā)現(xiàn)PDGF-bb聯(lián)合BMP-2生長(zhǎng)因子在可注射性水凝膠三維培養(yǎng)環(huán)境中在促進(jìn)成骨分化方向上具有協(xié)同作用。
[Abstract]:Preface錛，

本文編號(hào)：1872416