本文選題：BMP2 + 多肽　； 參考：《華中科技大學》2013年博士論文

【摘要】：第一部分兩種不同BMP2活性多肽的親骨性評價 目的對比研究兩種不同BMP-2活性多肽的親骨性,以探討影響多肽親骨性的相關因素。 方法以固相合成法分別合成兩種不同的BMP-2活性多肽P20和P24,在P24中增加設計聚天冬氨酸短肽和磷酸化絲氨酸活性位點。以納米羥基磷灰石晶體模擬骨組織,采用經典的吸附法對兩種多肽進行初步的體外骨吸附性能研究,分別在不同吸附時間和不同質量羥基磷灰石介質的條件下考察兩種多肽對羥基磷灰石的吸附率。 結果兩種BMP-2活性多肽在30min內均能與羥基磷灰石迅速吸附,此后隨時間延長吸附速度減緩,P20在60min時吸附率達到峰值,而P24在90min時達到峰值,為P20的兩倍。兩種多肽的吸附率隨著羥基磷灰石質量的增多而升高,在5mg、10mg和15mg三種不同羥基磷灰石量時P24的吸附率均顯著高于P20(P0.05),P24對15mg羥基磷灰石的吸附率幾乎是同樣條件下P20的3倍。 結論通過加入聚天冬氨酸和磷酸化絲氨酸活性位點可顯著增強BMP-2活性多肽的親骨性,P24具有良好的親骨性。親骨性BMP-2活性多肽對羥基磷灰石的最佳吸附時間是90min,且其吸附率與羥基磷灰石質量呈正相關。 第二部分攜載不同BMP2活性多肽的仿生骨基質材料體外控釋及其對MC3T3-E1細胞粘附、增殖及成骨分化能力的影響 目的觀察兩種BMP-2活性多肽的體外釋放動力學,評價不同多肽和仿生骨基質材料對小鼠MC3T3-E1前成骨細胞粘附、增殖和成骨分化能力的影響。 方法將兩種不同的BMP-2活性多肽P20和P24分別與TBC和nHAC/PLA兩種載體材料復合,構建P20/TBC、P20/nHAC/PLA、P24/TBC和P24/nHAC/PLA仿生骨基質材料,同時以P24/可吸收膠原蛋白海綿緩釋體為對照比較BMP-2活性多肽在各種支架材料中的釋放動力學。為評價各仿生骨基質材料的生物學活性,將實驗分為空白對照、P20和P24三組,每組另設TBC和nHAC/PLA兩個亞組。分別將小鼠MC3T3-E1前成骨細胞種植在各組材料表面,分別測定細胞在材料表面的粘附率,采用MTT法檢測MC3T3-E1細胞在材料上的增殖活性,通過檢測堿性磷酸酶(ALP)活性來評價MC3T3-E1細胞在各組材料上的成骨分化活性。 結果體外控釋實驗發(fā)現(xiàn)P24和P20無論在nHAC/PLA還是TBC材料中,均較P24在ACS材料中釋放更加緩慢,同時P24較P20在兩種材料中的緩釋效果更突出。而細胞粘附率、MTT實驗及ALP活性檢測結果顯示,MC3T3-E1細胞在所有多肽組仿生骨基質材料表面的粘附和增殖能力及ALP活性均顯著高于空白組,而在P24組顯著高于P20組,在P24/TBC組顯著高于P24/nHAC/PLA組,組間差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 結論TBC和nHAC/PLA均適合作為BMP-2活性多肽的緩釋載體材料,且TBC尤為理想。親骨性可明顯增強P24在TBC和nHAC/PLA材料中的緩釋性能,并能明顯促進小鼠MC3T3-E1前成骨細胞在材料上的粘附、增殖和成骨分化。 第三部分不同BMP2活性多肽／仿生骨基質材料復合物體內誘導異位成骨的實驗研究 目的比較P20和P24與TBC和nHAC/PLA構建的仿生骨基質材料的異位成骨能力,探討親骨性對多肽骨誘導活性的影響。 方法將30只SD大鼠隨機分為空白組、P20組及P24組,每組下設煅燒骨和nHAC/PLA兩個亞組。每只大鼠制備雙側股四頭肌肌袋模型,按實驗分組分別于左側放入TBC材料,右側放入nHAC/PLA材料。植入材料后第2、8周分別做放射學檢測(X-ray、3D-CT)并記錄植入體CT骨密度值(HU)。術后2、8周分別處死大鼠取材,應用高分辨率Micro CT測定標本內羥基磷灰石總體積值(BV),然后標本行HE染色組織學檢測。 結果8周時X線檢測可見P24組植入體密度均較2周時增高,P20及空白組密度變化不明顯。CT掃描骨密度檢測結果顯示,8W時P20/TBC組、P24/TBC組植入體骨密度值較2W時明顯增高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。而空白組、P20/nHAC/PLA組和P24/nHAC/PLA組植入體骨密度值較2W時僅略增高,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。BV定量結果顯示：在TBC組,2W和8W時P24組BV值均顯著高于其他各組,P20組僅8W時顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。nHAC/PLA組在2W時各組間無顯著性差異(P0.05),8W時P24組BV值顯著高于其他各組,P20組顯著高于空白組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。組織形態(tài)學觀察2周時P24/TBC組植入體孔隙內可看到散在的類骨質形成。8周時P24/TBC組可見大量編織骨形成、有較多活躍的成骨細胞及新生血管結構。P24/nHAC/PLA組新生骨組織明顯少于P24/TBC組。P20組僅見散在類骨質形成�？瞻捉M無明顯成骨。 結論煅燒骨和nHAC/PLA均是理想的骨組織工程支架材料,增加親骨性后能顯著增強BMP-2活性多肽與兩種材料復合構建的仿生骨基質材料的異位成骨能力 第四部分親骨性BMP2活性多肽/煅燒骨復合支架材料修復犬橈骨臨界性缺損的實驗研究 目的觀察親骨性BMP-2活性多肽P24/煅燒骨復合材料修復犬橈骨臨界性骨缺損的能力,探討其進一步應用的可行性。 方法6只比格犬制備雙側橈骨中段20mm臨界性骨缺損,按側別隨機分為4組,空白對照組骨缺損處不放置任何植入物,TBC組植入單純TBC材料,P24組植入P24/TBC復合材料,BMP2組植入rhBMP2/TBC復合材料。術后12周和24周分別行X線檢測,術后24周取材行CT掃描加三維重建并行組織學檢測評價各組材料的骨修復能力。 結果影像學及組織學檢測結果均提示空白對照組骨缺損處無新骨形成；TBC組各時間點影像學檢查均無明顯骨痂形成,骨-材料界面無明顯融合,組織學觀察可見缺損內少許類骨質和編織骨形成,無板層骨結構；P24組在12W時骨-材料界面模糊,有少許骨痂形成,24W時較多骨痂形成,骨-材料界面已融為一體。組織學可見缺損內較多新骨形成,有大量板層骨連接成片,可見大量活躍成骨細胞,骨-材料界面完全融合。BMP2組結果和P24組相似。P24組和BMP2組新生骨面積百分比與TBC組比較有非常顯著性差異(P0.01),P24組和BMP2組間無顯著性差異(P0.05)。 結論自行研制的P24/TBC復合支架材料具有良好的骨誘導活性,是一種理想的組織工程骨修復材料,值得進行進一步的臨床前研究。
[Abstract]:Evaluation of the affinity of two different BMP2 active polypeptides in the first part

Objective To investigate the affinity of two different BMP - 2 active polypeptides in order to investigate the relative factors influencing the affinity of polypeptide .

Methods Two different BMP - 2 active polypeptides ( P20 and P24 ) were synthesized by solid - phase synthesis . In P24 , poly ( aspartic acid ) short peptide and phosphorylated Ser active site were designed . The bone tissue was simulated by nano hydroxyapatite crystal . The adsorption rate of the two polypeptides on hydroxyapatite was investigated under different adsorption time and different mass of hydroxyapatite medium .

Results The adsorption rate of the two kinds of BMP - 2 polypeptides increased with the increase of hydroxyapatite mass , and the adsorption rate of P24 to 15 mg hydroxyapatite was almost 3 times higher than that of P24 at 5 mg , 10 mg and 15 mg .

Conclusion The affinity of BMP - 2 active polypeptide can be significantly enhanced by the addition of poly - aspartic acid and phosphorylating serine . The best adsorption time of bone - like BMP - 2 active polypeptide on hydroxyapatite is 90 min , and its adsorption rate is positively correlated with the quality of hydroxyapatite .

In vitro controlled release of bionic bone matrix material carrying different BMP2 active polypeptides and its effect on cell adhesion , proliferation and osteogenic differentiation of MC3T3 - E1 cells

Objective To observe the in vitro release kinetics of two BMP - 2 active polypeptides , evaluate the effects of different polypeptides and biomimetic bone matrix materials on the adhesion , proliferation and osteogenic differentiation of MC3T3 - E1 in mice .

Methods Two kinds of different BMP - 2 active polypeptides were prepared by combining two different BMP - 2 active polypeptides , respectively , and the release kinetics of BMP - 2 active polypeptide in various scaffold materials was established by using P24 / TBSA as control .

Results In vitro controlled - release experiment , P24 and P24 were released more slowly than P24 in ACS material , while P24 was more prominent than that of P24 in both materials . The results of MTT assay and ALP activity showed that MC3T3 - E1 cells had higher adhesion and proliferation ability and ALP activity in all polypeptide groups than in blank group .

Conclusion The release properties of P24 can obviously enhance the release properties of P24 in the materials of TB3T3 - E1 , and can obviously promote the adhesion , proliferation and osteogenic differentiation of MC3T3 - E1 osteoblasts in mice .

Experimental study of ectopic osteogenesis induced by different BMP2 active polypeptide / bionic bone matrix composites in vitro

Objective To compare the ectopic osteogenesis of the bionic bone matrix material constructed by p20 and P24 with TBCs and nJs / PLA , and to investigate the influence of bone affinity on the osteoinductive activity of the polypeptide .

Methods Thirty SD rats were randomly divided into two groups : blank group , P20 group and P24 group . Each group was divided into two sub - groups of calcined bone and n \

Results Compared with control group , the values of bone mineral density were significantly higher than those in control group ( P0.05 ) .

Conclusion It is ideal bone tissue engineering scaffold material for both the calcined bone and nits / PLA , which can significantly enhance the ectopic osteogenesis of the bionic bone matrix material of BMP - 2 active polypeptide and two materials .

Experimental study on repairing the critical defect of canine radial bone with the fourth partial bone affinity BMP2 active polypeptide / calcined bone composite scaffold material

Objective To investigate the ability of bone morphogenetic protein - 2 ( BMP - 2 ) active polypeptide P24 / calcined bone composite to repair the critical bone defect in dogs .

Methods Six Beagle dogs were randomly divided into 4 groups , and no implants were placed in the blank control group . All the implants were implanted into the bone defect of the blank control group , the P24 / TBCs were implanted in the group P24 , the BMP2 group was implanted with the rhBMP2 / TBCs . After 12 weeks and 24 weeks after operation , the X - ray examination was performed , and the bone repair capacity of the materials was evaluated by CT scanning and three - dimensional reconstruction parallel histological examination at 24 weeks after operation .

Results The results of imaging and histological examination indicated that there was no new bone formation at the bone defect of the blank control group .
There was no obvious callus formation at all time points of the group , no obvious fusion was observed in the interface of the bone - material , the histological observation showed that there were little bone and braided bone formation in the defect , and no lamellar bone structure was observed .
There was no significant difference in bone - material interface between P24 group and BMP2 group ( P0.01 ) , there was no significant difference between P24 group and BMP2 group ( P0.05 ) .

Conclusion It is an ideal tissue engineering bone repairing material which is worthy of further pre - clinical research .

【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R314

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本文編號：1862168