本文關(guān)鍵詞：微流控和單細(xì)胞分選技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《天津醫(yī)科大學(xué)》 2015年

微流控和單細(xì)胞分選技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用研究

呂曉慶  

【摘要】：目的:近年來,隨著微流控技術(shù)和二代測序技術(shù)的不斷發(fā)展,微流控芯片在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用越來越廣,而單細(xì)胞分析也引起了越來越多的關(guān)注。本文首先開發(fā)了一種用于體外抗高血壓藥物評估的仿真微流控芯片裝置;其次,鑒于現(xiàn)有的分離單細(xì)胞技術(shù)的不足,建立一種鑒定、富集和挑選單細(xì)胞的系統(tǒng)。方法:(1)①用軟光刻技術(shù)以PDMS為材料制作出內(nèi)部管道尺寸為長4 cm、寬2 mm、高100μm的PDMS-玻璃微流控芯片。芯片用FN在37℃包被1 h,在芯片上種入HUVECs并培養(yǎng);②利用一個微流注射泵、一個注射器、一個數(shù)字壓力計、接頭和軟管與芯片搭建為一套微流控芯片加壓系統(tǒng),通過微流注射泵設(shè)置流速,數(shù)字壓力計顯示壓力,給芯片內(nèi)培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞施加合適的壓力;③實(shí)驗(yàn)時,在壓力為0 KPa、12 KPa、18 KPa下,分別通入藥物濃度分別為0,50,250,500μmol/L的培養(yǎng)液,實(shí)驗(yàn)分兩組:第一組加壓時和加壓后都對細(xì)胞給藥,第二組只在加壓后對細(xì)胞給藥.微流控芯片放入培養(yǎng)箱中,加壓系統(tǒng)其它部分則留在外面;④加壓后收集加壓過程和加壓之后的培養(yǎng)液,做ELISA用于檢測ET-1釋放,用鼠抗人CD62P抗體和羊抗鼠Alexa Fluor 546二抗、Alexa Fluor488 phalloidin、DAPI對細(xì)胞進(jìn)行染色,把芯片置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。(2)①計算機(jī)作為整個系統(tǒng)的控制中樞,三軸電缸作為384孔板液體自動分配器,顯微操作儀控制毛細(xì)玻璃針的位置,顯微注射泵控制細(xì)胞的吸吐,顯微鏡用于拍照和實(shí)時顯示。②用C++編寫程序控制系統(tǒng)各個部件,生成第一步384孔板和第二步玻璃微坑操作的圖形用戶界面;③為了實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的高效富集,用兩個步驟實(shí)現(xiàn)富集和挑選功能:第一步,使用384孔板對樣品進(jìn)行初篩:樣品經(jīng)預(yù)處理后制備成細(xì)胞懸液,平均分配到384孔板中,顯微鏡下對孔板每個孔依次成像,用軟件輔助判斷目標(biāo)細(xì)胞所在的孔,并將孔中所有細(xì)胞收集;第二步:將第一步收集的細(xì)胞平鋪到玻璃微坑上,對整個細(xì)胞液滴進(jìn)行成像,軟件輔助判斷目標(biāo)細(xì)胞在液滴中所在位置,通過顯微操作儀和顯微注射泵控制玻璃針,將目標(biāo)細(xì)胞吸入,并吐出細(xì)胞至載玻片上的油滴里;④為了檢驗(yàn)系統(tǒng)挑細(xì)胞的效率,將轉(zhuǎn)染了RFP熒光蛋白的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231摻入到乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的摻雜樣品作為實(shí)驗(yàn)樣品。設(shè)置五組實(shí)驗(yàn),分別將1個、2個、5個、10個和20個MDA-MB-231-RFP細(xì)胞摻入100萬個MCF-7細(xì)胞中,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。將小鼠肝癌腫瘤組織作為樣品,經(jīng)組織消化后制備成單細(xì)胞懸液,在系統(tǒng)上挑取單個肝癌細(xì)胞,用全基因組、轉(zhuǎn)錄組和單細(xì)胞甲基化方法對細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增、建立文庫并用Illumina Hiseq 2500高通量測序平臺進(jìn)行測序。結(jié)果:(1)①使用微流注射泵、電子壓力計、微流控芯片、接頭盒軟管所搭建加壓系統(tǒng)可用于研究內(nèi)皮細(xì)胞對壓力和藥物的響應(yīng);②細(xì)胞Alexa Fluor 488phalloidin、DAPI染色結(jié)果表明壓力越大,F-肌動蛋白細(xì)胞骨架被破壞,隨著加入藥物濃度的增加,F-肌動蛋白微絲重新排列;③細(xì)胞CD62P和DAPI染色結(jié)果表明壓力增加,刺激細(xì)胞分泌P選擇素,藥物濃度增加,P選擇素分泌減少;④ET-1檢測實(shí)驗(yàn)表明,內(nèi)皮細(xì)胞釋放ET-1隨著壓力的增加而增加,隨著藥物濃度增加而減少。(2)①所搭建的挑細(xì)胞系統(tǒng)可在程序控制下正常工作;②384孔板和第二步玻璃微坑操作的圖形用戶界面可輔助實(shí)驗(yàn)圖像識別,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)保存以及實(shí)時顯示功能;③摻雜實(shí)驗(yàn)表明系統(tǒng)挑取單細(xì)胞效率可達(dá)60%以上;④小鼠腫瘤細(xì)胞樣品實(shí)驗(yàn)表明系統(tǒng)可挑取組織消化后單細(xì)胞樣品并成功用于全基因組、轉(zhuǎn)錄組和甲基化測序分析。結(jié)論:(1)本論文所搭建的微流控芯片加壓系統(tǒng)具有操作簡單、成本低等優(yōu)點(diǎn),可成功用于抗高血壓藥物對受壓力損傷后內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)作用的評估;(2)本論文提出了一種實(shí)現(xiàn)極少量細(xì)胞富集、挑取的方法,并搭建了實(shí)現(xiàn)此方法的半自動化系統(tǒng),使用此系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞的挑取。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R318;Q-33
【目錄】：

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【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：180745