本文選題：骨組織工程 + 成骨��； 參考：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2013年博士論文

【摘要】：研究背景及目的： 隨著科技的進(jìn)步和社會的發(fā)展,以及環(huán)境因素的改變,大面積創(chuàng)傷、嚴(yán)重的感染性疾病(包括結(jié)核)以及骨腫瘤的發(fā)生率較幾十年前有了明顯的提高。再加上以上疾病尤其是腫瘤,術(shù)中需要大量切除組織,從而造成大面積的組織缺損尤其是骨缺損。在骨科領(lǐng)域里,大面積骨缺損的治療是治療上的重點(diǎn)、難點(diǎn)。植骨成為治療這類疾病的唯一選擇。植骨的原料主要包括自體骨、同種異體骨、異種骨以及人工骨。自體骨由于其良好的骨誘導(dǎo)性和骨傳導(dǎo)性,多年來一直為植骨材料選擇的“金標(biāo)準(zhǔn)”,具有良好的治療效果,但存在來源有限、修復(fù)范圍局限的缺點(diǎn),且由于存在供區(qū)創(chuàng)傷還可能導(dǎo)致供區(qū)并發(fā)癥如取骨區(qū)疼痛等。同種異體骨及異種骨不存在骨量受限以及取骨區(qū)并發(fā)癥的缺點(diǎn),因而能夠明顯增加修復(fù)骨缺損的范圍,但缺點(diǎn)在于存在移植后排斥反應(yīng),遠(yuǎn)期療效不及自體骨。人工合成骨是近年來開始出現(xiàn)的一種仿生骨,隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)成為替代上述幾種骨的熱門選擇,并已開始廣泛應(yīng)用于臨床。羥基磷灰石(Hydroxyapatite,HA)作為其中一種人工骨材料,因?yàn)槠渲饕煞峙c骨骼相似,已開始作為組織工程支架應(yīng)用于骨科臨床,療效肯定。另一方面,支架材料的孔徑大小和孔隙率被認(rèn)為在影響細(xì)胞擴(kuò)增和活性可能起到重要的作用。因此,我們將此材料行體外立體培養(yǎng),觀察不同孔隙率的材料其對細(xì)胞擴(kuò)增及活性影響有無區(qū)別,再將其植入實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi),觀察此種材料是否能夠促進(jìn)骨缺損愈合。 方法： 首先用擠出成形加微波燒結(jié)的方法制備不同孔徑、同孔隙率、孔徑之間完全連通的多孔羥基磷灰石支架材料。之后將材料按照不同孔徑大小分為2組,每組6個：A組為設(shè)計時孔徑在150μm左右的支架材料,B組為設(shè)計時孔徑在300μm左右的支架材料。于相差顯微鏡下觀察材料孔隙情況并根據(jù)刻度尺測量材料孔徑(每個材料隨意選取5個孔測量孔徑,取平均值作為單個材料的孔徑,不同孔徑的每組材料用此法測6個樣品,取平均值為該組材料的孔徑),并用排水法計算其孔隙率,求平均值作為該組材料的孔隙率。再將燒結(jié)后的支架材料與原羥基磷灰石粉末行物相分析,將其XRD圖譜與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫比對,觀察經(jīng)制備工藝后的支架材料其物相有無變化。最后將材料行SEM掃描,觀察其表面孔隙情況,以獲得材料的基本物理信息。 其次,將小鼠原成骨細(xì)胞MC3T3-E1(由美國菌種保存中心提供)接種于DMEM高糖培養(yǎng)基,在37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)、復(fù)蘇并傳代。之后將MC3T3-E1細(xì)胞懸液垂直滴入滅菌后的直徑12mam、高度5mm的圓柱型支架材料(按照材料學(xué)部分實(shí)驗(yàn)中的分法分為A、B兩組)孔隙內(nèi)部行初步種植,之后將其轉(zhuǎn)移到灌注培養(yǎng)反應(yīng)器上行灌注培養(yǎng)5天(液體流速3.4ml/min,37℃,5%CO2).灌注培養(yǎng)結(jié)束后,行MTT法來比較不同孔隙率的材料之間細(xì)胞增殖能力是否不同。之后再測量單位時間內(nèi)的葡萄糖消耗來反應(yīng)細(xì)胞的代謝活性,從而比較不同孔隙率的材料之間細(xì)胞代謝活性有無不同。最后將標(biāo)本固定、脫水、干燥后噴金,并于掃描電鏡下觀察貼壁細(xì)胞的增殖情況以及活性。 選新西蘭大白兔30只,按照一定的隨機(jī)化方法隨機(jī)分為6組：A組,無孔材料組,6只,在左側(cè)尺骨制造長度為1.Ocm的骨缺損,并植入長5mm、寬5mm、高10mm的立方體材料；B組,150μm孔徑組,6只,手術(shù)方式同A組；C組,300μm孔徑組,6只,手術(shù)方式同A組；D組,500μm孔徑組,6只,手術(shù)方式同A組；E組,單純骨缺損組,3只,僅制造骨缺損動物模型,不做材料植入；F組,單純喂養(yǎng)組,3只,不做任何手術(shù)處理。于術(shù)后4、8周分別處死動物,將術(shù)側(cè)尺、橈骨完整取出,行CT掃描+三維重建觀察大體骨缺損愈合情況,行Micro-CT評估支架內(nèi)骨長入情況。 結(jié)果： 擠壓成形技術(shù)配合微波高溫?zé)Y(jié)法可以根據(jù)預(yù)先設(shè)計模型制備出內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜的羥基磷灰石支架材料,其孔徑分別為(149.0±6.8)μm和(294.3±8.5)μm,孔隙率分別為(36.7±0.1)%和(52.2±0.2)%。燒結(jié)前后的材料行物相分析,均提示為單一的羥基磷灰石成分,此法制備多空羥基磷灰石支架不會使材料變性、分解,但衍射峰半高寬變窄。掃描電鏡顯示兩種材料的內(nèi)部結(jié)構(gòu)均規(guī)則,孔隙為方形,相互連通性良好,行表面觀察見羥基磷灰石顆粒呈不規(guī)則多邊形,相互緊密排列,但個別顆粒之間有微孔形成。 采用灌注培養(yǎng)的方法成功在兩組支架材料上培養(yǎng)大量成骨細(xì)胞,MTT法結(jié)果顯示A組OD/質(zhì)量比值1.31±0.26,B組OD/質(zhì)量比值1.51±0.43,兩組均值之間比較p0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。葡萄糖消耗結(jié)果顯示A組葡萄糖消耗量(162.38±33.09)μmol/L,B組葡萄糖消耗量(217.97±27.91)mol/L,兩組均值之間比較p小于0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。掃描電鏡結(jié)果顯示兩組支架材料內(nèi)部均有大量的成骨細(xì)胞粘附其上,并由孔隙角落逐漸朝孔隙中央生長。單個的成骨細(xì)胞粘附向周圍伸出偽足,并分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)。 動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果,術(shù)后4周,大體觀察,4組材料-骨界面之間均有明顯縫隙,術(shù)后8周時除A組之外其余3組縫隙相對模糊。普通CT結(jié)果,術(shù)后4周時,僅D組材料周圍可見少量新生骨痂,術(shù)后8周時A組可見髓腔封閉,其余3組可見新生骨痂,以D組最多。Micro-CT結(jié)果,術(shù)后4周時3組有孔材料內(nèi)類骨樣物質(zhì)均較少,術(shù)后8周時孔隙內(nèi)類骨樣物質(zhì)明顯增多。 結(jié)論： 擠出成型技術(shù)結(jié)合高溫?zé)Y(jié)的方法是一種成功有效地制備具有復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)的多空羥基磷灰石支架材料的方法,能夠制備不同孔徑、不同孔隙率、空隙間連通性良好的支架材料,且經(jīng)過制備工藝后材料成分不會發(fā)生改變。 通過灌注培養(yǎng)的方法能夠使成骨細(xì)胞粘附與支架材料之上,并快速增殖。其中,孔徑越大、孔隙率越大,成骨細(xì)胞的代謝活性越強(qiáng)。 多孔羥基磷灰石支架材料有一定的誘導(dǎo)體內(nèi)成骨的能力,并且誘導(dǎo)能力隨著孔徑增大、孔隙率增大而逐漸增大。
[Abstract]:Research background and purpose:
With the progress of science and technology and social development, as well as the change of environmental factors, the incidence of large area trauma, serious infectious diseases (including tuberculosis) and bone tumors has been significantly improved over the past few decades. Bone defect. In the Department of orthopedics, the treatment of large area bone defects is the focus of treatment. Bone graft is the only choice for the treatment of these diseases. The material of bone graft mainly includes autogenous bone, allograft, xenogeneic bone, and artificial bone. Autogenous bone has been selected for many years for bone graft materials. The choice of "gold standard" has good therapeutic effect, but there is a shortcoming of limited source and limited scope of repair. Because of the existence of donor site trauma, the donor area may also lead to the pain of the donor area, such as the pain in the bone area. But the disadvantage lies in the existence of rejection after transplantation and the long-term effect is inferior to that of autogenous bone. Artificial bone is a bionic bone that began to appear in recent years. With the development of tissue engineering, it has become a hot alternative to these kinds of bone, and it has been widely used in clinical practice. Hydroxyapatite (HA) has been widely used as a new type of bone. One kind of artificial bone material, because its main component is similar to the skeleton, has begun to be used as a tissue engineering scaffold in the Department of orthopedics, with a positive effect. On the other hand, the size and porosity of the scaffold may play an important role in affecting cell expansion and activity. Therefore, this material is cultured in vitro, There is no difference in the effect of different porosity materials on the cell expansion and activity, and then it is implanted into the experimental animal to observe whether this material can promote the healing of bone defect.
Method錛，

本文編號：1792285