發(fā)布時(shí)間：2018-04-21 10:05

  本文選題：腺病毒 + β-神經(jīng)生長(zhǎng)因子�。� 參考：《山東大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的神經(jīng)元細(xì)胞是人體內(nèi)再生能力最差的細(xì)胞之一,其構(gòu)成的神經(jīng)系統(tǒng)亦是人體內(nèi)至關(guān)重要的系統(tǒng)之一,因此神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生損傷往往會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的不可逆的后果[1,2]。如何實(shí)現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞損傷后神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)、再生直至神經(jīng)系統(tǒng)功能恢復(fù)一直是相關(guān)學(xué)科的研究重點(diǎn)及難點(diǎn)[3-6]。本實(shí)驗(yàn)將組織工程學(xué)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)及干細(xì)胞治療技術(shù)有機(jī)結(jié)合,為修復(fù)脊髓損傷(SCI)提供了新的方向[7,8]。成功修復(fù)脊髓損傷的關(guān)鍵在于:①種子細(xì)胞的選擇和培養(yǎng);②具有理想生物相容性的三維立體框架材料的構(gòu)建[9-19];③有助于神經(jīng)恢復(fù)的微環(huán)境的創(chuàng)建。本課題選擇神經(jīng)元細(xì)胞細(xì)胞基質(zhì)主要構(gòu)成之一透明質(zhì)酸(HA)作為三維立體框架主要原材料,制造該HA水凝膠復(fù)合支架,將可以穩(wěn)定分泌β-神經(jīng)生長(zhǎng)因子(β-NGF)的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)與接枝Nogo-66受體抗體(NgR抗體)和多聚左旋賴(lài)氨酸(PLL)的HA支架共培養(yǎng),評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染了β-NGF基因的EPCs與嫁接NgR抗體以及PLL的HA支架的生物相容性,研究該HA支架作為修復(fù)SCI的組織工程學(xué)框架載體的可能性,為通過(guò)有機(jī)結(jié)合組織工程學(xué)及干細(xì)胞治療技術(shù)治療脊髓損傷等疾病提供研究基礎(chǔ)。方法以冰凍干燥方法制備多孔HA水凝膠框架材料,將NgR抗體和PLL通過(guò)化學(xué)接枝法接枝到HA水凝膠支架上。提取EPCs,體外培養(yǎng),取第三代EPCs用于試驗(yàn)研究,并通過(guò)攜帶β-NGF基因的腺病毒將其轉(zhuǎn)染,然后將EPCs與支架共培養(yǎng)。通過(guò)掃描電鏡觀察HA水凝膠的內(nèi)部結(jié)構(gòu),通過(guò)細(xì)胞活力檢測(cè)(CCK-8)及HE染色法觀察EPCs在支架上的生長(zhǎng)情況,通過(guò)檢測(cè)支架/細(xì)胞復(fù)合物乳酸脫氫酶釋放量評(píng)價(jià)HA水凝膠支架材料細(xì)胞毒性,通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)、實(shí)時(shí)定量熒光PCR(Real Time-PCR)、蛋白免疫印跡法(Western blot)評(píng)估β-NGF基因在體外的表達(dá)、釋放情況。結(jié)果成功培養(yǎng)出EPCs,其生長(zhǎng)良好、增值活躍,腺病毒攜帶β-NGF轉(zhuǎn)染EPCs后其可以穩(wěn)定表達(dá)β-NGF。制造的HA水凝膠支架具備理想的三維孔狀結(jié)構(gòu),EPCs在支架上生長(zhǎng)良好,且明顯優(yōu)于EPCs在培養(yǎng)板內(nèi)生長(zhǎng),HA水凝膠支架的細(xì)胞毒性較培養(yǎng)板相比無(wú)明顯差異,且β-NGF在支架上表達(dá)與對(duì)照組相比存在明顯的優(yōu)勢(shì)。結(jié)論轉(zhuǎn)染了β-NGF的EPCs生長(zhǎng)旺盛并且能夠穩(wěn)定表達(dá)β-NGF,可以作為神經(jīng)組織工程學(xué)的種子細(xì)胞。EPCs可以在接枝NgR抗體和PLL的透明質(zhì)酸水凝膠支架上穩(wěn)定增值、表達(dá),說(shuō)明EPCs與接枝NgR抗體和PLL的透明質(zhì)酸水凝膠支架有良好的生物相容性。該HA支架可以作為修復(fù)SCI的組織工程學(xué)載體。
[Abstract]:Objective Neuron cell is one of the worst regenerative cells in human body, and its nervous system is also one of the most important systems in human body. Therefore, neuronal cell damage often leads to serious irreversible consequences [1 / 2]. How to repair and regenerate the nerve cells after neuronal cell injury, until the function of the nervous system is restored, has always been the focus and difficulty of related disciplines [3-6]. In this study, tissue engineering, transgenic technology and stem cell therapy were combined to provide a new direction for the repair of spinal cord injury (SCI). The key to the successful repair of spinal cord injury lies in the selection of seed cells of 1 / 1 and the construction of 3 dimensional frame material with ideal biocompatibility [9-19] 3 which is helpful to the establishment of microenvironment for nerve recovery. In this study, hyaluronic acid (HA), one of the main components of neuronal cell matrix, was used as the main raw material of three-dimensional framework to fabricate the HA hydrogel composite scaffold. Endothelial progenitor cells (EPCs), which secrete 尾 -NGF stably, were co-cultured with grafted Nogo-66 receptor antibody (NgR) and poly (L-lysine) (PLL) HA scaffold. To evaluate the biocompatibility of EPCs transfected with 尾 -NGF gene and grafted NgR antibody and HA scaffold of PLL, and to study the possibility of using the scaffold as a tissue engineering framework carrier for SCI repair. To provide a basis for the treatment of spinal cord injury by organically combining tissue engineering and stem cell therapy. Methods porous HA hydrogel frame material was prepared by freeze drying method. NgR antibody and PLL were grafted onto HA hydrogel scaffold by chemical grafting method. EPCs were extracted and cultured in vitro. The third generation of EPCs was used for the experimental study. The EPCs was transfected by adenovirus carrying 尾 -NGF gene, and then co-cultured with the scaffold. The internal structure of HA hydrogel was observed by scanning electron microscope (SEM), the growth of EPCs on the scaffold was observed by cell viability test (CCK-8) and HE staining. The cytotoxicity of HA hydrogel scaffold was evaluated by detecting the release of lactate dehydrogenase from scaffold / cell complex. The expression of 尾 -NGF gene in vitro was evaluated by enzyme-linked immunosorbent assay (Elisa), real-time quantitative fluorescence PCR(Real Time-PCRN and Western blotting. Release. Results EPCs were cultured successfully, and their growth was good and the proliferation was active. Adenovirus carrying 尾 -NGF could stably express 尾 -NGF after transfection into EPCs. The HA hydrogel scaffolds had ideal three-dimensional pore structure. EPCs grew well on the scaffold, and the cytotoxicity of HA hydrogel scaffolds was significantly better than that of EPCs in culture plate. The expression of 尾-NGF on the scaffold was significantly superior to that of the control group. Conclusion EPCs transfected with 尾 -NGF has a strong growth and stable expression of 尾 -NGF, which can be used as seed cells of neural tissue engineering. EPCs can be expressed on the scaffold of NgR antibody and PLL hydrogel with hyaluronic acid. The results showed that EPCs had good biocompatibility with NgR antibody and PLL hydrogel scaffold. The HA scaffold can be used as a tissue engineering carrier for SCI repair.
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R318.08

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本文編號(hào)：1781966