本文選題：組織工程 + 水凝膠　； 參考：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：關(guān)節(jié)創(chuàng)傷所致的疼痛、畸形、活動(dòng)度下降已經(jīng)成為目前肢體功能不全甚至殘疾的主要原因之一[1]。在關(guān)節(jié)創(chuàng)傷疾病中，軟骨的損傷尤其重要[2]。由于關(guān)節(jié)軟骨本身的營養(yǎng)來自于關(guān)節(jié)液的滲透交換作用，并無血管和神經(jīng)，所以一旦發(fā)生關(guān)節(jié)疼痛，軟骨病變已進(jìn)入晚期，且目前臨床治療方法療效局限[3-6]。 近年，運(yùn)用組織工程的思路進(jìn)行軟骨病損的臨床治療，已有一些安全性較好、療效肯定的方法，例如自體軟骨細(xì)胞移植（ACI）、基質(zhì)誘導(dǎo)自體軟骨細(xì)胞移植（MACI）等。這些組織工程技術(shù)的出現(xiàn)揭示了運(yùn)用組織工程的思路進(jìn)行軟骨修復(fù)是未來軟骨病損疾病治療的趨勢。但是，ACI以及MACI具有自體軟骨細(xì)胞來源有限、需要二次手術(shù)及自體軟骨供區(qū)并發(fā)癥等局限，因此其適用范圍較局限。 軟骨基質(zhì)仿生水凝膠具有生物相容性好、促進(jìn)種子細(xì)胞成軟骨分化及表達(dá)Ⅱ型膠原蛋白、維持軟骨細(xì)胞形態(tài)的作用[7,8]。因此，本研究在微創(chuàng)、仿生理念的指導(dǎo)下，從豬膝關(guān)節(jié)軟骨中提取了Ⅱ型膠原蛋白并對其純度及成分進(jìn)行了初步鑒定；運(yùn)用堿中和法制備了豬透明軟骨Ⅱ型膠原（CollagenⅡ，COLⅡ）水凝膠，并對其水解率、溶脹度等相關(guān)理化特性進(jìn)行了初步檢測；通過與骨髓來源干細(xì)胞（主要包括間充質(zhì)干細(xì)胞）進(jìn)行4周共培養(yǎng)對其細(xì)胞相容性的觀察以及單純凝膠小鼠背部皮下埋植實(shí)驗(yàn)1周、3周、9周對其組織相容性的觀察，本研究對其生物相容性進(jìn)行了初步評價(jià)；運(yùn)用基質(zhì)仿生理念[9-11]，在前期試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過復(fù)合正常軟骨細(xì)胞外基質(zhì)-硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）、透明質(zhì)酸（hyaluronan，HA）與COLⅡ，課題組制備出了仿生的COLⅡ-CS-HA復(fù)合水凝膠；并對COLⅡ及COLⅡ-CS-HA復(fù)合骨髓來源干細(xì)胞修復(fù)豬股骨滑車全厚軟骨缺損的效果進(jìn)行了短期（4周）的現(xiàn)象觀察。通過3.0T高場強(qiáng)磁共振檢測、大體觀察、體視顯微鏡觀察、組織學(xué)染色等方法，課題組認(rèn)為COLⅡ以及COLⅡ-CS-HA復(fù)合水凝膠均可以對豬膝關(guān)節(jié)全厚軟骨缺損進(jìn)行修復(fù)，且后者修復(fù)物中Ⅱ型膠原含量較前者更好。 一、實(shí)驗(yàn)方法 1．豬膝關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原蛋白（COLⅡ）的提取及鑒定 本研究從豬膝關(guān)節(jié)透明軟骨中提取了Ⅱ型膠原蛋白，通過氨基酸分析、聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、番紅O染色、搖菌實(shí)驗(yàn)等方法，對自提膠原蛋白的性質(zhì)、純度、濃度進(jìn)行了初步評價(jià)。 2．COLⅡ水凝膠制備及相關(guān)理化性能、生物相容性實(shí)驗(yàn)： ①運(yùn)用堿中和原理，制備出在4℃為溶膠態(tài)，37℃、6-8min相變?yōu)槟z態(tài)的COLⅡ凝膠，并且對其微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。 ②體外水解實(shí)驗(yàn)對制備的COLⅡ水凝膠的水解度、溶脹度及含水量進(jìn)行初步評價(jià)。 ③COLⅡ水凝膠-骨髓來源干細(xì)胞（主要為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞）共培養(yǎng)4周，運(yùn)用HE染色、固綠-番紅O染色、阿爾新藍(lán)染色初步對凝膠的細(xì)胞相容性進(jìn)行初步評價(jià)。 ④COLⅡ水凝膠昆明小鼠背部皮下埋植1周、3周、9周后，運(yùn)用HE染色、Mallory染色，，對凝膠的組織相容性進(jìn)行初步評價(jià)。 3．COLⅡ-CS-HA復(fù)合水凝膠的制備 運(yùn)用基質(zhì)仿生的理念，在前部分實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，課題組將自提Ⅱ型膠原蛋白（COLⅡ），及購買的醫(yī)用硫酸軟骨素（CS）、透明質(zhì)酸（HA）復(fù)合，構(gòu)建了Ⅱ型膠原蛋白-硫酸軟骨素-透明質(zhì)酸復(fù)合水凝膠，并且對其大體性狀及微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。 4．COLⅡ與COLⅡ-CS-HA復(fù)合凝膠對保留鈣化層的豬膝關(guān)節(jié)滑車全厚軟骨缺損修復(fù)效果進(jìn)行4周短期初步的現(xiàn)象觀察。 ①3.0T MRI對復(fù)合凝膠的修復(fù)效果進(jìn)行在體無創(chuàng)觀察 ②大體及體視顯微鏡，對缺損的表面及剖面進(jìn)行大體觀察 ③組織學(xué)染色對其修復(fù)效果進(jìn)行觀察 ④免疫組化染色對缺損修復(fù)物性質(zhì)進(jìn)行觀察 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1．豬膝關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原蛋白（COLⅡ）的提取及鑒定。反復(fù)實(shí)驗(yàn)后，本實(shí)驗(yàn)每次取50g豬膝關(guān)節(jié)透明軟骨后可提取出3-4g的Ⅱ型膠原蛋白。經(jīng)凍干后測定，自制Ⅱ型膠原-HCl溶膠濃度為66mg/ml，濃度高、純度好，經(jīng)過SDS-PAGE電泳及氨基酸分析鑒定，實(shí)驗(yàn)室自提Ⅱ型膠原蛋白基本符合COLⅡ的蛋白質(zhì)組學(xué)特點(diǎn)。 2．COLⅡ水凝膠的制備與評價(jià)： 2.1掃描電子顯微鏡（SEM）示所制備的COLⅡ凝膠具有均勻的孔分布及良好的孔連通性； 2.2水解實(shí)驗(yàn)示，COLⅡ水凝膠20天后水解率為30%左右；通過比較凍干前后質(zhì)量，測量其溶脹度為2684%，含水量在90%以上； 2.3細(xì)胞相容性實(shí)驗(yàn)示骨髓來源干細(xì)胞在水凝膠中能夠正常懸浮生長并且分裂，未發(fā)現(xiàn)明顯細(xì)胞空泡及細(xì)胞核的破裂、溶解； 2.4昆明小鼠背部皮下埋植實(shí)驗(yàn)示水凝膠材料在1w時(shí)還有部分存在于皮下且有炎細(xì)胞浸潤；3w時(shí)材料基本消失，炎細(xì)胞較1w時(shí)明顯減少；9w時(shí)材料被完全吸收，未發(fā)現(xiàn)明顯炎細(xì)胞浸潤。 3．COLⅡ-CS-HA復(fù)合水凝膠的制備。SEM示制備的Ⅱ型膠原蛋白-硫酸軟骨素-透明質(zhì)酸復(fù)合水凝膠具有較好的孔分布及孔連通性。 4．4周貴州小香豬動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果： 4.13.0T高場強(qiáng)磁共振觀察示：軟骨層可以在MRI中清晰顯影，各組關(guān)節(jié)腔內(nèi)未發(fā)現(xiàn)明顯滑膜增生及關(guān)節(jié)積液；復(fù)合了骨髓來源干細(xì)胞的水凝膠（包括COLⅡ及COLⅡ-CS-HA）組，在缺損處均能觀察到較高信號的修復(fù)組織生成，軟骨下骨及深部骨髓未見明顯異常信號；未復(fù)合細(xì)胞的水凝膠（包括COLⅡ及COLⅡ-CS-HA）組在缺損處也能觀察到較高信號生成，但較復(fù)合細(xì)胞組信號弱，且在軟骨下骨有異常信號。 4.2大體及體視顯微鏡示無論是否復(fù)合細(xì)胞，在缺損處均能觀察到修復(fù)物填充；復(fù)合了骨髓來源干細(xì)胞的水凝膠（包括COLⅡ及COLⅡ-CS-HA）組，在缺損處能觀察到淡白色均質(zhì)的修復(fù)組織生成，其性狀及飽滿度均優(yōu)于未復(fù)合細(xì)胞的水凝膠（包括COLⅡ及COLⅡ-CS-HA）組。 4.3組織學(xué)及免疫組化染色示：復(fù)合了骨髓來源干細(xì)胞的水凝膠組（包括COLⅡ及COLⅡ-CS-HA）修復(fù)效果優(yōu)于未復(fù)合細(xì)胞的水凝膠組；在復(fù)合了骨髓來源干細(xì)胞的水凝膠組（包括COLⅡ及COLⅡ-CS-HA），固綠-番紅O染色及阿爾新藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)在缺損邊緣及底部均有陽性染色，且在該組缺損處可以找到分化的軟骨細(xì)胞，提示局部可能有軟骨蛋白多糖生成；天狼星紅及Ⅱ型膠原免疫組化染色示仿生構(gòu)建的種子細(xì)胞+COLⅡ-CS-HA復(fù)合水凝膠組其修復(fù)組織中細(xì)胞密度高且Ⅱ型膠原含量高于種子細(xì)胞-Ⅱ型膠原蛋白水凝膠組，提示前者修復(fù)反應(yīng)更強(qiáng)烈且修復(fù)物性質(zhì)較種子細(xì)胞+COLⅡ水凝膠組更類似于透明軟骨。 三、全文結(jié)論 1．本研究提取的Ⅱ型膠原蛋白純度高、濃度好，其蛋白質(zhì)組學(xué)性質(zhì)基本符合Ⅱ型膠原蛋白特點(diǎn)。 2．本研究制備的Ⅱ型膠原蛋白水凝膠具有較好的組織及細(xì)胞相容性。 3．本研究構(gòu)建的Ⅱ型膠原蛋白-硫酸軟骨素-透明質(zhì)酸水凝膠復(fù)合骨髓來源干細(xì)胞后對豬股骨滑車全厚軟骨缺損有短期的修復(fù)效果，且修復(fù)物近似于透明軟骨。 但是，本課題未對水凝膠材料的具體理化特性（包括粘彈性、體內(nèi)酶解性等）及生物安全性（包括急慢性炎癥反應(yīng)、溶血反應(yīng)及遺傳毒性等）進(jìn)行深入研究，而且缺乏長期的大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)修復(fù)效果評價(jià)。關(guān)于這些方面的內(nèi)容將在以后的工作中進(jìn)行深入探討。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R318.08

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1764307