本文選題：殼聚糖 + 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞�。� 參考：《華中科技大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：第一部分包裹骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的殼聚糖/β-甘油磷酸鈉水凝膠的制作及相關(guān)研究 目的研究溫敏型殼聚糖/β-甘油磷酸鈉(chitosan/β-glycerol phosphate C/GP)水凝膠的制作以及作為細(xì)胞載體對(duì)其中的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchyme stem cells, BMSCs)粘附、生長(zhǎng)、和增殖的影響。 方法將殼聚糖(chitosan, CS)與β-甘油磷酸鈉(β-glycerol phosphate,GP)按照3：1的比例混合后放置于37℃溫度條件下可形成固態(tài)水凝膠。將體外培養(yǎng)、擴(kuò)增的兔BMSCs與C/GP溶液混合、固化形成水凝膠后制作冰凍切片行蘇木素-伊紅(HE)染色觀察其粘附和生長(zhǎng)情況；通過(guò)CCK8法和死/活細(xì)胞熒光染色法檢測(cè)BMSCs在C/GP水凝膠中的生長(zhǎng)、增殖情況。 結(jié)果BMSCs/C/Gp混合溶液置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)10mins可固化形成水凝膠。BMSCs與C/GP溶液混合培養(yǎng)14天后,細(xì)胞增值數(shù)量多,其形態(tài)為長(zhǎng)梭形,伸展良好。冰凍切片HE染色顯示：C/GP水凝膠呈現(xiàn)均質(zhì)紅染,有孔隙樣結(jié)構(gòu)；BMSCs分布較均勻,形態(tài)大部分為圓形,胞核藍(lán)染,呈圓形或橢圓形。CCK8法測(cè)定實(shí)驗(yàn)組光吸收值與對(duì)照組比較,除第2天有顯著性差異(P0.05)外,第4、6、8天比較均無(wú)顯著性差異(P0.05)。死/活細(xì)胞熒光染色顯示：培養(yǎng)14天后,實(shí)驗(yàn)組中BMSCs絕大多數(shù)被染成綠色,極少量死細(xì)胞被染成紅色。細(xì)胞形態(tài)為多邊形,伸展良好。活細(xì)胞比率和活細(xì)胞密度與對(duì)照組比較均無(wú)顯著性差異(P0.05)。 結(jié)論C/Gp溫敏型水凝膠在接近于人體內(nèi)體溫的條件下可長(zhǎng)期保持水凝膠狀態(tài),C/Gp溫敏型水凝膠對(duì)BMSCs無(wú)細(xì)胞毒性且適合細(xì)胞粘附和生長(zhǎng),為進(jìn)一步試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。 第二部分新型磷酸鈣骨水泥材料的制作及其細(xì)胞毒性、機(jī)械性能、孔隙結(jié)構(gòu)的相關(guān)研究 目的探討新型大孔隙磷酸鈣骨水泥(calcium phosphate cement,CPC)材料支架的細(xì)胞毒性和對(duì)細(xì)胞粘附、生長(zhǎng)和增殖的影響。 方法新型CPC在固相的混合過(guò)程中,首先將細(xì)化后的磷酸四鈣(tetracalcium phosphate,TTCP)和磷酸氫鈣(dicalcium phosphate anhydrous,DCPA)粉末按1：1(摩爾比)的比例配制成CPC固體粉末；再將質(zhì)量比為50%的水溶性甘露醇晶體加入到CPC固體粉末中用來(lái)制造大孔隙。應(yīng)用磷酸鹽緩沖液為固化液。將CPC固體粉末與固化液按照2g：1ml的比例在研缽中混合均勻,得到糊狀混合物,即CPC面團(tuán)。通過(guò)CCK8法檢測(cè)細(xì)胞在新型CPC材料浸提液中的生長(zhǎng)增殖情況；通過(guò)電子掃描電鏡測(cè)試材料孔徑；應(yīng)用力學(xué)三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)測(cè)試新型CPC的生物力學(xué)性能。 結(jié)果通過(guò)掃描電鏡觀察和測(cè)量,新型CPC材料的孔徑值達(dá)到267.43±118.01μm,而傳統(tǒng)CPC材料的孔徑值只有6.66±2.58μm,兩者比較具有顯著性差異(p0.05)；新型CPC材料孔隙率為66.15±6.91%,傳統(tǒng)CPC材料孔隙率為35.02±4.71%,兩者比較具有顯著性差異(p0.05)。新型CPC材料的最大負(fù)荷、抗彎強(qiáng)度和堅(jiān)韌度較傳統(tǒng)CPC均增加了約1倍(p0.05),明顯提高了其負(fù)荷承載能力。CCK8法檢測(cè)出新型CPC材料浸提液與細(xì)胞共培養(yǎng)不同時(shí)間后其光密度值(optical density value, OD)值與陰性對(duì)照組均無(wú)顯著性差異(p0.05)。新型CPC材料細(xì)胞毒性評(píng)級(jí)為1級(jí),即該材料對(duì)BMSCs無(wú)明顯毒性。 結(jié)論新型CPC材料具有強(qiáng)大的生物力學(xué)性能、大孔隙、高孔隙率和良好的生物相容性,有望成為理想的骨組織工程支架。 第三部分新型磷酸鈣骨水泥混合材料(包含包裹骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的殼聚糖水凝膠和甘露醇晶體)中細(xì)胞活性和成骨分化的相關(guān)研究 目的研究溫敏型C/GP水凝膠對(duì)包裹其中的BMSCs在CPC自凝固化過(guò)程中的保護(hù)作用以及BMSCs在新型CPC混合材料(包含包裹骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的殼聚糖水凝膠和甘露醇晶體)中的粘附、增殖和成骨分化情況。 方法將體外培養(yǎng)、擴(kuò)增的兔BMSCs與C/GP溶液混合置于培養(yǎng)板底層,放置37℃條件下固化形成水凝膠；將CPC面團(tuán)置于培養(yǎng)板中水凝膠層的上方,放置37℃條件下固化。通過(guò)CCK8法和死／活細(xì)胞熒光染色法檢測(cè)包裹于C/GP水凝膠中的BMSCs通過(guò)CPC自凝固化過(guò)程后的細(xì)胞生存及增殖活性；通過(guò)組織化學(xué)方法檢測(cè)堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性；茜素紅染色檢測(cè)鈣化結(jié)節(jié)的表達(dá),RT-PCR檢測(cè)ALP和降鈣素(calcitonin, CT)mRNA的表達(dá)。通過(guò)電子掃描電鏡觀察BMSCs在新型CPC材料中的生長(zhǎng)及粘附情況。 結(jié)果包裹于C/GP水凝膠中的BMSCs在CPC材料中培養(yǎng)14天后的死/活細(xì)胞熒光染色顯示：活細(xì)胞比率為(78.77±2.66)%,同單純BMSCs細(xì)胞懸液組(82.07±4.30)%和C/GP水凝膠組(80.03±3.08)%比較無(wú)顯著性差異(p0.05)；活細(xì)胞密度為(82.54±4.17)%,同單純BMSCs細(xì)胞懸液組(86.374±4.81)%和C/GP水凝膠組(83.63±5.20)%比較亦無(wú)顯著性差異(p0.05)。包裹于C/GP水凝膠中的BMSCs在CPC材料中使用成骨培養(yǎng)基培養(yǎng)7天和14天后,ALP、茜素紅染色均為陽(yáng)性同對(duì)照組無(wú)差異(p0.05)；RT-PCR結(jié)果亦顯示ALP和CT的mRNA基因表達(dá)明顯增強(qiáng)。BMSCs在新型CPC復(fù)合支架材料上培養(yǎng)5天掃描電子顯微鏡顯示BMSCs向CPC材料的孔隙深部長(zhǎng)入并且緊緊地附著在類似納米羥基磷灰石骨礦物質(zhì)材料上。 結(jié)論溫敏型C/GP水凝膠對(duì)包裹其中的BMSCs在CPC自凝固化過(guò)程中可起到保護(hù)作用,新型CPC復(fù)合支架材料無(wú)細(xì)胞毒性,其三維孔隙結(jié)構(gòu)及材料特性適合BMSCs粘附、生長(zhǎng)、增殖和成骨分化。 第四部分兔橈骨缺損模型制作及新型磷酸鈣骨水泥材料對(duì)骨折缺損模型的治療效果 目的研究兔橈骨缺損模型的制作以及觀察新型CPC材料對(duì)兔橈骨缺損模型的修復(fù)治療效果。 方法選用12只成年健康的新西蘭大白兔沿其雙側(cè)前臂橈側(cè)暴露橈骨中段截取約1cm骨干制造骨缺損模型。其中6只為試驗(yàn)組植入新型CPC,另6只為對(duì)照組植入傳統(tǒng)CPC。分別于手術(shù)當(dāng)天、術(shù)后第4周、8周和第12周行雙上肢X線片檢查,于術(shù)后第12周行雙上肢MRI檢查、組織切片HE染色觀察和生物力學(xué)測(cè)定。 結(jié)果新型CPC材料植入兔橈骨缺損處后未出現(xiàn)炎性、排斥等不良反應(yīng)。術(shù)后第4周、8周和12周X線片檢查顯示試驗(yàn)組骨折缺損修復(fù)情況明顯優(yōu)于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后12周螺旋CT三維重建可見(jiàn)橈骨缺損區(qū)域與周圍正常骨質(zhì)整合完整,骨組織爬行替代理想,骨折缺損間隙模糊消失。對(duì)照組橈骨缺損區(qū)域植入的傳統(tǒng)CPC材料降解吸收,骨折缺損依舊存在,與周圍正常骨質(zhì)無(wú)明顯連接整合。術(shù)后第12周,通過(guò)組織形態(tài)學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)組成骨及塑形等方面明顯優(yōu)于對(duì)照組。兔橈骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)結(jié)果顯示：術(shù)后第12周實(shí)驗(yàn)組的最大負(fù)荷(Fmax)、抗彎曲強(qiáng)度(Flexural strength)和載荷/位移(F/d)與對(duì)照組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。而實(shí)驗(yàn)組彈性模量與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05) 結(jié)論新型CPC材料具有良好的生物相容性、降解性和細(xì)胞活性,對(duì)兔橈骨缺損模型的修復(fù)具有良好的治療效果,對(duì)于作為理想的骨組織工程支架具有光明的前景。
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【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R318.08

【參考文獻(xiàn)】

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1 宋大立;李春明;劉寶林;楊春艷;梁玲;;Bio-Oss膠原支架材料體外結(jié)構(gòu)及細(xì)胞黏附生長(zhǎng)觀察[J];哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2007年03期

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本文編號(hào)：1747115