本文選題：富血小板血漿 + 乳牙牙髓干細胞��； 參考：《南方醫(yī)科大學》2014年博士論文

【摘要】：口腔醫(yī)學領(lǐng)域很多常見病如牙周疾病、腫瘤、創(chuàng)傷等常常造成骨組織缺損,目前治療骨組織缺損的方法主要有兩種：自體骨移植和加工的異體或異種骨移植。近些年隨著再生醫(yī)學概念的確立以及組織工程技術(shù)的發(fā)展,采用患者體內(nèi)來源的干細胞(種子細胞)在體外構(gòu)建缺損組織,然后回植到患者體內(nèi)組織缺損部位進行重建這一模式,成為解決骨組織缺損治療難題的一個發(fā)展方向。構(gòu)建組織工程骨主要包括干細胞、支架材料和促進成骨作用的生長因子。間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)被普遍認為是組織工程骨的理想種子細胞,研究表明其在體外適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下,可以向成骨細胞、成軟骨細胞、成纖維細胞、脂肪細胞和成肌細胞等多種間充質(zhì)來源的中胚層組織細胞分化。 Gronthos等于2000年利用酶消化的方法,將人類健康的第三磨牙牙髓制備成單細胞懸液并培養(yǎng),得到具有形成細胞克隆能力和高度增殖能力的細胞,將其命名為牙髓干細胞(dental pulp stem cells, DPSCs)。Miura等于2003年從脫落乳牙的牙髓中分離到具有高度增殖能力和多向分化能力的干細胞,命名為乳牙牙髓干細胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth, SHED)。將SHED、 DPSCs和骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs)進行比較發(fā)現(xiàn),三種細胞都具備間充質(zhì)干細胞的特征,包括成纖維細胞樣形態(tài)和表達間充質(zhì)干細胞特異性表面標記物。Gronthos將DPSCs與BMMSCs進行了對比研究,在同樣的接種密度下,每一萬個DPSCs可形成22-70個細胞克隆,而每一萬個BMMSCs僅可形成2.4～3.1個細胞克隆,說明成人牙髓干細胞具有較高的集落形成能力,并推測牙髓組織中干細胞的比例可能高于骨髓組織。Miura發(fā)現(xiàn)從脫落乳牙獲得的SHED每12-20個細胞即可以形成黏附克隆集落,而且與BMMSCs和DPSCs比較,SHED有著更強的增殖能力�；虮磉_譜顯示,SHED和DPSCs有4386個基因存在兩倍以上的差異,在涉及細胞增殖和細胞外基質(zhì)分泌信號通路的基因方面,SHED的表達明顯高于DPSCs。SHED在體外經(jīng)誘導培養(yǎng)后可分化為成骨細胞,形成三維編織骨樣結(jié)構(gòu)；而在體內(nèi)則不同,Miura將SHED接種于裸鼠體內(nèi),SHED不直接分化為成骨細胞,而是誘導宿主細胞分化為成骨細胞,這與DPSCs及其他牙齒組織來源的干細胞有一定的區(qū)別。鑒于SHED可能有著更為強大的體外增殖以及多向分化潛能,并且有可能具有誘導骨再生的特性,人脫落乳牙牙髓作為潛在的間充質(zhì)干細胞龕,很可能是理想的成骨細胞源庫,SHED所形成的礦化組織有可能用于骨再生、骨移植及其他臨床治療。 由于乳牙牙髓的組織量較小,在臨床應用的準備階段,需要在體外將細胞進行大量擴增。胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)是最常應用于細胞培養(yǎng)的物質(zhì),它為細胞的增殖、遷移和分化等生物學行為提供營養(yǎng)、生長因子和激素等生物活性物質(zhì)。然而,FBS的應用由于可能涉及到倫理、科學以及安全問題,限制了其應用于臨床。目前大量的研究在探索應用其他培養(yǎng)介質(zhì)替代FBS用于干細胞的體外培養(yǎng)。 富血小板血漿(platelet-rich plasma, PRP)是自體全血經(jīng)離心后得到的血小板濃縮物,含有大量的血小板和少量的其他血細胞。血小板中含有豐富的生長因子,包括血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor, PDGF),堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF),胰島素樣生長因子(insulin-like growth facter, IGF),轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-b,TGF-β)和血管內(nèi)皮生長因子等,這些細胞因子在細胞的各種生物學行為中都發(fā)揮著重要作用。 一系列基礎(chǔ)研究證實,PRP可以促進間充質(zhì)干細胞、成骨細胞和成纖維細胞等增殖、遷移和分化,且這種作用具有濃度特異性和細胞特異性。與FBS相比,PRP可以促進人MSCs增殖,減少細胞達到融合的時間,增加細胞集落形成單位(colony forming unit, CFU)的大小,并且可以保持其成骨、成軟骨和成脂分化能力,維持免疫抑制活性。用流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn),MSCs表達高水平的PDGF、bFGF、TGF-β和IGF受體,這表明血小板中的各種生長因子可以作用于MSCs。在無血清培養(yǎng)基中加入TGF-β、PDGF和bFGF,MSCs可以保持長梭形存活5代,MSC的增殖能力與加10%FBS的DMEM相差無幾,并且仍保持多向分化的能力。在MSCs的增殖和分化過程中,PDGF、FGF和TGF-β信號通路起著重要作用,PDGF可能是PRP促進MSCs增殖和遷移的關(guān)鍵因子,其通過ERK信號通路影響細胞的有絲分裂。選擇性地抑制PDGF受體激酶,骨細胞的形成明顯減少,并且不能形成礦化結(jié)節(jié)：同時細胞增殖速率顯著降低。 PRP可促進DPSCs增殖,相對于FBS而言,PRP促增殖能力更強,且不改變DPSCs的免疫表型、CFU及多向分化能力。PRP通過PI3K/AKT和MAPK信號通路促進牙髓細胞的增殖和蛋白合成。PRP處理過的DPSCs高表達成牙本質(zhì)基因和成骨基因,通過上調(diào)骨橋蛋白(osteoprotein, OPG)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)促進礦化。在一定濃度范圍內(nèi),DPSCs的增殖能力與PRP呈濃度依賴性,但是高濃度的PRP則抑制DPSCs的增殖。由于PRP的來源及制備方法不同,尚無法確定其促進增殖和成骨分化的最佳濃度。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),10～30%的PRP可明顯提高牙髓細胞ALP活性,其中以20%濃度尤為明顯；10～30%的PRP明顯促進了礦化誘導10天后的牙髓細胞形成礦化結(jié)節(jié),其中10%濃度在礦化誘導20天后牙髓細胞形成的礦化結(jié)節(jié)最大。 基于以上國內(nèi)外研究現(xiàn)狀和本課題組的前期研究成果,我們提出以下工作設(shè)想：(1)通過方法學的改良,在保持有效生長因子濃度的前提下,使PRP的制備和激活方式更加簡便高效,更易于進行標準化,更利于提高科研的重復性和臨床的可靠性；(2)一定濃度的改良富血小板血漿(modified platelet-rich plasma, mPRP)可以在體外更好地促進SHED的體外增殖,mPRP可以替代FBS成為組織工程骨所需干細胞體外快速擴增的培養(yǎng)基質(zhì)；(3)在成骨誘導的條件下,mPRP有可能促進SHED在體外向成骨方向分化,從而提高組織工程骨的構(gòu)建效率。為驗證以上設(shè)想,本課題通過制備mPRP,并應用不同濃度的mPRP對SHED進行體外擴增培養(yǎng)以及成骨誘導分化。 本論文主要包括以下四章內(nèi)容： 第一章：乳牙牙髓干細胞的分離培養(yǎng)和鑒定 用酶消化法分離培養(yǎng)乳牙牙髓干細胞。經(jīng)HE染色,見細胞多數(shù)呈長梭形,成纖維細胞樣,少數(shù)呈多角形或卵圓形；利用CCK-8法檢測細胞增殖能力,繪制細胞生長曲線顯示,隨培養(yǎng)時間延長,細胞數(shù)量增加,在第3至4天進入快速增長期,第6天進入增殖平臺期,其生長特性符合干細胞增殖的一般特征；免疫細胞化學技術(shù)染色結(jié)果顯示角蛋白陰性,波形蛋白陽性,說明細胞來源于間充質(zhì)而非表皮；通過流式細胞術(shù)檢測細胞表面標記物,有99.69%的細胞CD44陽性,90.13%的細胞CD105陽性,抗體CD34為陰性,說明細胞僅表達間充質(zhì)干細胞特異性表面標記物,而不表達造血干細胞特異性表面標記物；將細胞在礦化誘導培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)30天,茜素紅染色后發(fā)現(xiàn)有大量的礦化結(jié)節(jié)形成,表明SHED具有向成骨細胞方向分化的能力；將細胞在成脂誘導培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)21天,油紅-O染色后可見透明高亮度點,表明SHED具有向脂肪細胞方向分化的能力。本實驗獲取的SHED增殖能力強,表達間充質(zhì)干細胞特異性表面標記物,在不同誘導條件下可向成骨細胞和脂肪細胞等方向分化,是后續(xù)實驗良好的體外細胞模型。 第二章：改良富血小板血漿的制備與激活 收集4份經(jīng)檢驗合格的人AB型機采血小板,加入肝素,混勻后進行血小板計數(shù),3×103r/min離心20mmin,吸棄部分上清,將血小板濃度調(diào)至約1×1012個/L,吸管反復吹打使血小板重新懸浮制備成為PRP；將PRP分裝入凍存管內(nèi),浸入液氮罐5分鐘,迅速取出浸入37℃水浴箱5分鐘,反復三次,使血小板充分凍融裂解；3×103r/min離心20分鐘,去除血小板沉渣,0.2μm過濾。應用酶聯(lián)免疫吸附試驗法定量檢測富血小板血漿中PDGF-AA和TGF-β1的質(zhì)量濃度,PDGF-AA的濃度為19.159μg/L, TGF-β1的濃度為57.163μg/L,與其他研究者制備所得的PRP中主要生長因子的濃度相當。 第三章：改良富血小板血漿對乳牙牙髓干細胞增殖作用研究 將第4代SHED按不同培養(yǎng)條件分為4個實驗組和1個對照組,實驗組在a-MEM培養(yǎng)基中分別加入2%,5%,10%和20%mPRP;對照組在a-MEM培養(yǎng)基中加入10%FBS。以1×104/mL,200μL/孔接種于96孔板,每組4個復孔,在培養(yǎng)的第1至7天,CCK-8法測定孵育2小時后于450nm波長處OD值,繪制細胞生長曲線。采用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果表明,不同濃度的mPRP均可以促進SHED的增殖,且不同濃度的mPRP促進SHED增殖的作用不盡相同,其中以2%的mPRP促增殖能力最強。在整個細胞培養(yǎng)周期,2%mPRP與10%FBS促增殖作用無統(tǒng)計學差異；5%mPRP在培養(yǎng)的中后期,對SHED的促增殖作用與對照組無統(tǒng)計學差異,而高濃度的mPRP對SHED的促增殖作用反而較弱。mPRP有可能替代FBS用于SHED的體外擴增。 第四章：改良富血小板血漿對乳牙牙髓干細胞成骨分化作用研究 將生長狀態(tài)良好的第4代SHED按不同培養(yǎng)條件分為4個實驗組和1個對照組,實驗組在a-MEM培養(yǎng)基中分別加入1%,2%,5%和10%nPRP;對照組在a-MEM培養(yǎng)基中加入10%FBS。各組均加入礦化誘導液進行誘導礦化。培養(yǎng)2、4、6天后,按照堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)試劑盒說明操作,520nm處酶標儀測各孔吸光度(OD)值,檢測細胞ALP活性。結(jié)果顯示,不同濃度mPRP均可增強SHED堿性磷酸酶活性,尤其是在第6天的時候,各實驗組與對照組相比均具有顯著性差異(P0.05),其中濃度為2%mPRP對SHED堿性磷酸酶活性的促進作用最大(P0.01)。礦化誘導7天后,qRT-PCR檢測RUNX2和骨鈣素(osteocalcin, OCN)的mRNA含量,比較各組間SHED的RUNX2和OCN mRNA表達的差異。結(jié)果顯示,mPRP對SHED內(nèi)RUNX2和OCN mRNA表達促進作用具有濃度特異性,礦化誘導第7天時,2%mPRP組RUNX2和OCN mRNA表達量顯著高于對照組,10%mPRP組OCN mRNA表達量與對照組無顯著性差異,而10%mPRP組RUNX2mRNA表達量反而顯著低于對照組。 綜上所述,本課題通過對PRP的制備和激活方法進行改良,在保證有效生長因子的濃度下,使mPRP的性狀更易標準化；用不同濃度的mPRP對SHED分別進行體外擴增和成骨誘導,發(fā)現(xiàn)一定濃度的mPRP對SHED的增殖和骨向分化均具有一定的促進作用。選擇具有更強體外增殖和成骨能力的SHED,并采用同體來源的mPRP進行體外培養(yǎng),有可能解決目前制約體外組織工程骨構(gòu)建中所存在的難題,從而提高組織工程骨體外構(gòu)建的效率,降低成本,并增加臨床治療的安全性。本實驗結(jié)果為mPRP和SHED更好地應用于骨組織工程提供了一定的實驗依據(jù)。
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【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R318

【參考文獻】

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1 劉中寧;姜婷;王衣祥;;富血小板血漿促進人牙髓細胞的體內(nèi)礦化潛能[J];北京大學學報(醫(yī)學版);2011年02期

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本文編號：1741431