本文選題：肝星狀細(xì)胞 + 永生化�。� 參考：《浙江大學(xué)》2013年博士論文

【摘要】：研究背景 各種原因引起的肝衰竭病死率高達(dá)70%～80%。以肝細(xì)胞為生物活性成分的生物型人工肝(bioartificial liver, BAL)成為肝衰竭治療研究的熱點和發(fā)展方向。 基于原代人肝細(xì)胞、原代豬肝細(xì)胞、C3A肝腫瘤細(xì)胞的三種類型肝細(xì)胞的BAL臨床試驗治療顯示,BAL具有很好的療效和應(yīng)用前景。但是,肝細(xì)胞源的短缺等問題,依然阻礙著BAL的臨床應(yīng)用和發(fā)展。 肝臟干細(xì)胞可誘導(dǎo)分化為功能成熟的肝細(xì)胞,被認(rèn)為是非常有前景的細(xì)胞源。目前,肝臟干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)分化是受到多種因素影響和調(diào)控,分化后的肝細(xì)胞尚難達(dá)到生物人工肝臨床治療的數(shù)量。因此,需要進一步探索肝臟干細(xì)胞的規(guī)模化培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化的新方式和新方法。 肝細(xì)胞永生化是解決肝細(xì)胞來源困難的重要可行性途徑之一。然而,永生化人肝細(xì)胞的基因表達(dá)和細(xì)胞功能,與原代人肝細(xì)胞功能存在一定的差異。因此,必須在解決肝細(xì)胞數(shù)量的同時,需要進一步提高永生化人肝細(xì)胞的分化程度和細(xì)胞功能。 細(xì)胞與細(xì)胞間相互作用在保持和促進細(xì)胞功能中起著非常重要作用。在各種共培養(yǎng)體系中,肝細(xì)胞與肝非實質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用為肝細(xì)胞生長提供了微環(huán)境,有助于肝細(xì)胞保持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和細(xì)胞功能。肝星狀細(xì)胞是肝臟中非常重要的非實質(zhì)細(xì)胞。然而,原代肝星狀細(xì)胞存在著分離繁瑣,分離成本較高,容易失去生物學(xué)特性和功能等問題。 綜上所述,我們從以下幾個方面進行研究,建立高活性和功能的永生化人肝星狀細(xì)胞系,探索永生化人肝星狀細(xì)胞與永生化人肝細(xì)胞共培養(yǎng)對肝細(xì)胞功能的影響,以及探索永生化人肝星狀細(xì)胞對肝祖細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的影響。為優(yōu)化和完善永生化人肝細(xì)胞培養(yǎng)的微環(huán)境和建立肝祖細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的新方法提供實驗依據(jù),將為生物型人工肝提供更高質(zhì)量的肝細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。 第一部分永生化人肝星狀細(xì)胞系的建立及其鑒定 目的：建立高活性和功能的永生化人肝星狀細(xì)胞系,為肝非實質(zhì)細(xì)胞與肝細(xì)胞、肝祖細(xì)胞共培養(yǎng)研究提供理想的細(xì)胞模型。 方法：采用SV40LT重組反轉(zhuǎn)錄病毒感染原代人肝星狀細(xì)胞,獲得永生化人肝星狀細(xì)胞系。采用電鏡技術(shù)、RT-PCR等分析永生化人肝星狀細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、生物學(xué)特性和功能等。 結(jié)果：建立一株永生化人肝星狀細(xì)胞系,命名為HSC-Li。該細(xì)胞系具有典型的肝星狀細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征；HSC-Li細(xì)胞的Ⅰ、Ⅱ型膠原、HGF等mRNA表達(dá)為陽性；HSC-Li細(xì)胞的a-SMA、Vimentin、GFAP和SV40LT蛋白表達(dá)為陽性。HSC-Li細(xì)胞分泌VEGF、HGF、IL-6、TGF-betal等多種細(xì)胞因子和炎癥因子。 結(jié)論：建立了一株永生化人肝星狀細(xì)胞系HSC-Li,該細(xì)胞系具有人肝星狀細(xì)胞的生物學(xué)特性和功能；可為肝細(xì)胞與肝星狀細(xì)胞、肝祖細(xì)胞與肝星狀細(xì)胞共培養(yǎng)研究提供理想的細(xì)胞模型。 第二部分永生化人肝星狀細(xì)胞與永生化人肝細(xì)胞共培養(yǎng)對肝細(xì)胞功能的影響 目的：探索永生化人肝星狀細(xì)胞與永生化人肝細(xì)胞共培養(yǎng)對永生化人肝細(xì)胞功能的影響；為優(yōu)化和完善永生化人肝細(xì)胞培養(yǎng)的微環(huán)境提供實驗依據(jù)。 方法：首先采用SV40LT重組反轉(zhuǎn)錄病毒感染原代人肝細(xì)胞,獲得一株永生化人肝細(xì)胞系；通過直接接觸共培養(yǎng)、間接接觸共培養(yǎng)方式進行永生化人肝細(xì)胞與永生化人肝星狀細(xì)胞共培養(yǎng)研究,測定永生化人肝細(xì)胞共培養(yǎng)24h、48h、72h后ALB、 CYP3A5、CYP2E1、UGT2b7等基因的表達(dá)水平,以及測定CYP1A2活力。 結(jié)果：建立了一株永生化人肝細(xì)胞系HepLi5,HepLi5細(xì)胞的ALB、GS、CYP2E1、 CYP3A5等基因的mRNA表達(dá)均為陽性,具有分泌白蛋白等原代人肝細(xì)胞的生物學(xué)特性和功能。HSC-Li細(xì)胞與HepLi5細(xì)胞直接接觸和間接接觸共培養(yǎng)研究結(jié)果顯示,HepLi5細(xì)胞在共培養(yǎng)24h、48h、72h后ALB、CYP3A5、CYP2E1、UGT2b7等基因表達(dá)顯著增強,以及CYP1A2活力顯著增強。與單獨培養(yǎng)組相比較,直接接觸共培養(yǎng)方式和間接接觸共培養(yǎng)方式均顯著增強肝細(xì)胞基因表達(dá)和功能。 結(jié)論：建立了一株永生化人肝細(xì)胞系HepLi5,HepLi5細(xì)胞具有分泌白蛋白等原代人肝細(xì)胞的生物學(xué)特性和功能。直接接觸共培養(yǎng)和間接接觸共培養(yǎng)方式均可顯著增強HepLi5細(xì)胞的基因表達(dá)和細(xì)胞功能。為優(yōu)化和完善永生化人肝細(xì)胞培養(yǎng)的微環(huán)境提供實驗依據(jù),將為生物型人工肝提供更高質(zhì)量的肝細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。 第三部分永生化人肝星狀細(xì)胞對肝祖細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的影響 目的：探索永生化人肝星狀細(xì)胞對肝祖細(xì)胞BMEL-TAT分化為肝細(xì)胞的影響；為建立肝祖細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的新方法提供實驗依據(jù)。 方法：通過永生化人肝星狀細(xì)胞與肝祖細(xì)胞間接接觸共培養(yǎng)方式誘導(dǎo)肝祖細(xì)胞分化為肝細(xì)胞,檢測肝祖細(xì)胞BMEL-TAT共培養(yǎng)前、后細(xì)胞表型和功能。 結(jié)果：HSC-Li星狀細(xì)胞與肝祖細(xì)胞BMEL-TAT間接接觸共培養(yǎng)方式可以誘導(dǎo)肝祖細(xì)胞分化為功能成熟的肝細(xì)胞。以單獨培養(yǎng)BMEL-TAT細(xì)胞作為對照,與HSC-Li細(xì)胞共培養(yǎng)3天后,BMEL-TAT細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)上開始向肝樣細(xì)胞轉(zhuǎn)變；與HSC-Li細(xì)胞共培養(yǎng)7、14、21天后,BMEL-TAT細(xì)胞的ALB、CK18、TAT、G6P等基因表達(dá)逐漸增強；細(xì)胞免疫熒光染色顯示：共培養(yǎng)21天后BMEL-TAT細(xì)胞的ALB、CK18表達(dá)顯著增強,CK19、AFP表達(dá)下降。共培養(yǎng)21天后BMEL-TAT細(xì)胞的X-gal染色、PAS染色和Dil-LDL吸收實驗均為陽性,以及CYP1A2活力和尿素合成也顯著增強。 結(jié)論：建立了肝祖細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的新方法；永生化人肝星狀細(xì)胞與肝祖細(xì)胞間接接觸共培養(yǎng)方式可以誘導(dǎo)肝祖細(xì)胞BMEL-TAT向肝細(xì)胞分化；可為生物型人工肝提供新型、高質(zhì)量的肝細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:Background of the study

The mortality of liver failure caused by various reasons is as high as 70 % 锝，

本文編號：1740372