發(fā)布時(shí)間：2018-04-11 20:00

  本文選題：硅橡膠 + 孔徑　； 參考：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景皮膚作為人體最大的器官,對于維持并延續(xù)人的生命有著重要作用。作為機(jī)體對外防御的第一道屏障,皮膚具有保護(hù)人體免受物理、化學(xué)傷害的作用,同時(shí)防止細(xì)菌等微生物的入侵并維持體液和電解質(zhì)的平衡。生活中的燒傷、創(chuàng)傷等多種致傷因素均可導(dǎo)致皮膚結(jié)構(gòu)和功能的破壞,尤其對于大面積皮膚缺損的患者例如嚴(yán)重?zé)齻∪硕?由于缺乏皮膚屏障的保護(hù),將導(dǎo)致水電解質(zhì)紊亂、感染、能量和營養(yǎng)物質(zhì)的流失,從而嚴(yán)重威脅到人的生命。硅橡膠是一種具有多種優(yōu)良性能的高分子材料,例如較好的力學(xué)性能、化學(xué)穩(wěn)定性和氣體通透性,尤其值得一提的是,硅橡膠具有良好的生物相容性。這些優(yōu)良的性能,使得硅橡膠成為一種制備創(chuàng)面敷料的理想材料。雖然硅橡膠具有很好的生物相容性并可用作創(chuàng)面敷料的制備,但目前單純利用硅橡膠這種材料來制備敷料國內(nèi)外均未見相關(guān)報(bào)道。當(dāng)前硅橡膠的主要運(yùn)用方向仍是用作整形美容的填充物,或僅僅是用作一些人工皮膚/生物支架的外層保護(hù)薄膜。在本課題研究中,我們成功利用醫(yī)用硅橡膠制備了多孔薄膜,同時(shí)摸索了硅膠膜孔徑尺寸的調(diào)節(jié)方法并探討了不同孔徑硅橡膠薄膜的體內(nèi)外生物學(xué)作用及相關(guān)機(jī)制。由于已有的文獻(xiàn)報(bào)道各種多孔創(chuàng)面敷料/組織支架對于細(xì)胞增殖以及組織修復(fù)有著顯著影響,結(jié)合硅橡膠材料自身良好的理化性能及生物相容性,我們預(yù)測制備的多孔硅橡膠薄膜具有作為一種新型敷料應(yīng)用于燒創(chuàng)傷創(chuàng)面治療的潛力。雖然我們所制備的多孔硅橡膠薄膜具有作為新型敷料的應(yīng)用前景,但多孔硅橡膠薄膜對創(chuàng)面愈合有無影響、有何影響及其影響機(jī)制是什么仍有待闡明。同時(shí),根據(jù)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)一步優(yōu)化及確定多孔硅膠膜的相關(guān)制備參數(shù)顯得十分重要,并在此基礎(chǔ)上,模擬人皮膚的表皮-真皮樣雙層結(jié)構(gòu)制備性能更加完善的雙層復(fù)合仿生敷料。利用硅橡膠進(jìn)行仿生創(chuàng)面敷料的制備,是對硅橡膠材料應(yīng)用的進(jìn)一步拓展,并且為臨床皮膚創(chuàng)面的治療提供新的治療手段。目的本研究擬通過制備不同孔徑結(jié)構(gòu)的硅橡膠薄膜,并探索其對創(chuàng)面愈合的影響及其機(jī)制,從而優(yōu)化相關(guān)制備參數(shù),最終制備出一種新型雙層仿生敷料,為臨床皮膚創(chuàng)面的治療提供一種新的手段。方法1.不同孔徑結(jié)構(gòu)的硅橡膠薄膜的制備及孔徑結(jié)構(gòu)的觀察和測量通過溶劑揮發(fā)誘導(dǎo)的相分離法制備不同孔徑結(jié)構(gòu)的硅橡膠薄膜,掃描電鏡觀察孔徑的結(jié)構(gòu),并測量孔徑的尺寸;2.不同孔徑結(jié)構(gòu)硅膠膜的抗細(xì)菌侵襲能力通過向不同孔徑結(jié)構(gòu)的硅膠膜上表面接種細(xì)菌,平板計(jì)數(shù)法測量細(xì)菌穿透硅膠膜的量,比較硅膠膜不同的孔徑結(jié)構(gòu)阻擋細(xì)菌入侵的能力;3.不同孔徑結(jié)構(gòu)的硅膠膜對細(xì)胞增殖的影響及其增殖信號通路機(jī)制研究3.1分離原代綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein,gfp)轉(zhuǎn)基因新生鼠的成纖維細(xì)胞,并接種到不同孔徑結(jié)構(gòu)的硅膠膜表面,利用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞密度。同時(shí)掃描電鏡觀察細(xì)胞的生長形態(tài);3.2通過向不同孔徑結(jié)構(gòu)的硅膠膜上接種成纖維細(xì)胞,cellcounting-8(cck8)法測量細(xì)胞在不同孔徑結(jié)構(gòu)的硅膠膜上的增殖情況;碘化丙啶(propidiumiodide,pi)染色,流式檢測細(xì)胞周期;利用real-timepcr檢測接種到不同硅膠膜上的細(xì)胞中wnt3a,β-catenin及增殖細(xì)胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen,pcna)的表達(dá);同時(shí)westernblot(wb)技術(shù)檢測wnt/β-catenin信號通路的wnt3a,β-catenin,axin2,phosphorylatedgsk-3β(p-gsk-3β),gsk-3β,pcna的表達(dá)水平;最后在大孔徑硅膠膜組加入了wnt/β-catenin信號通路抑制劑xav939,檢測了細(xì)胞增殖及wnt/β-catenin信號通路的變化;4.不同孔徑結(jié)構(gòu)的硅膠膜對創(chuàng)面愈合的影響通過制備小鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面模型,并將制備的不同孔徑結(jié)構(gòu)的硅橡膠薄膜應(yīng)用于小鼠創(chuàng)面,觀察小鼠創(chuàng)面的大體愈合情況,創(chuàng)面收縮情況;制備病理切片,通過蘇木素-伊紅(hematoxylinandeosin,he)染色,利用imageproplus6.0(ipp6.0)軟件測量不同處理組的新生上皮長度;通過免疫組化及wb法檢測wnt3a,β-catenin和pcna在小鼠創(chuàng)面組織中的表達(dá)情況;5.雙層復(fù)合硅橡膠仿生敷料的構(gòu)建及相關(guān)生物學(xué)測試5.1通過使用不同配方的成膜溶液,進(jìn)行二次涂膜,構(gòu)建模擬人表皮-真皮樣雙層結(jié)構(gòu)的雙層硅橡膠仿生敷料。第一次涂膜使用液體硅橡膠前驅(qū)物/液體石蠟/正己烷的質(zhì)量比例為25/20/55w/w/w,涂膜厚度為1mm;第二次涂膜使用液體硅橡膠前驅(qū)物/液體石蠟/正己烷/司盤80的質(zhì)量比例為25/5/68/2w/w/w/w,涂膜厚度為0.5mm。超景深顯微鏡下觀察雙層敷料的雙層結(jié)構(gòu);5.2雙層復(fù)合硅橡膠仿生敷料的理化性能測試;5.3皮下包埋實(shí)驗(yàn)在體驗(yàn)證雙層復(fù)合硅橡膠仿生敷料的生物相容性;5.4利用小鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面模型,與空白對照組,凡士林紗布組和無孔硅膠膜組進(jìn)行對照,觀察雙層復(fù)合硅橡膠仿生敷料對創(chuàng)面愈合的影響;5.5制備組織病理切片,通過he染色測量創(chuàng)緣新生上皮長度和肉芽組織厚度,觀察雙層復(fù)合硅橡膠仿生敷料對創(chuàng)面愈合過程中上皮化和肉芽組織形成的影響;5.6通過pcna和cd31免疫組化染色,觀察雙層復(fù)合硅橡膠仿生敷料對創(chuàng)緣細(xì)胞增殖和創(chuàng)面血管化的影響;5.7制備冰凍切片,通過免疫熒光染色,觀察細(xì)胞連接分子鈣粘蛋白e(e-cadherin)的表達(dá)情況,從而初步探討雙層復(fù)合硅橡膠仿生敷料對創(chuàng)緣細(xì)胞移行的影響。結(jié)果1.成功制備了四種不同的硅橡膠薄膜,分別為極大孔徑硅膠膜,大孔徑硅膠膜,小孔徑硅膠膜和無孔硅膠膜,通過掃描電鏡圖片測得其中前三種硅膠膜其孔徑尺寸分別為218.03±17.95μm,110.47±14.03μm,5.27±1.44μm。無孔硅膠膜上無孔徑結(jié)構(gòu)形成;2.細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與凡士林紗布、極大孔徑、大孔徑結(jié)構(gòu)相比,小孔徑結(jié)構(gòu)和無孔硅膠膜可以顯著的阻擋細(xì)菌的入侵,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(**p0.01,n=3);3.不同孔徑結(jié)構(gòu)的硅膠膜對細(xì)胞增殖的影響及其增殖信號通路機(jī)制研究3.1我們成功分離培養(yǎng)了gfp轉(zhuǎn)基因新生鼠的成纖維細(xì)胞。在接種至不同孔徑的硅膠膜上后,熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn):大孔徑硅膠膜表面的細(xì)胞數(shù)量更多,密度更大;掃描電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)大孔徑硅膠膜上的成纖維細(xì)胞細(xì)胞狀態(tài)最好,呈典型的紡錘樣形態(tài),而其他硅膠膜表面的成纖維細(xì)胞則形態(tài)不規(guī)則、不典型;3.2通過cck8法檢測細(xì)胞在不同孔徑硅膠膜表面的增殖情況發(fā)現(xiàn):在接種后的第3天,大孔徑硅膠膜上的細(xì)胞數(shù)量顯著多于極大孔徑、小孔徑和無孔硅膠膜(**p0.01,n=3);接種后第六天,極大孔徑、小孔徑和無孔硅膠膜上的細(xì)胞數(shù)量較接種的第一天到第五天已經(jīng)出現(xiàn)明顯的下降趨勢,而大孔徑硅膠膜上的細(xì)胞數(shù)量仍進(jìn)一步增多,數(shù)量顯著多于極大孔徑、小孔徑和無孔硅膠膜(**p0.01,n=3);3.3real-timepcr檢測發(fā)現(xiàn),大孔徑硅膠膜組細(xì)胞增殖標(biāo)志物pcna的mrna表達(dá)水平最高,其次是極大孔徑硅膠膜組和小孔硅膠膜組,表達(dá)最低的是無孔硅膠膜組;同時(shí)檢測了wnt3amrna表達(dá)量,也發(fā)現(xiàn)大孔徑硅膠膜組表達(dá)量顯著高于極大孔徑、小孔徑和無孔硅膠膜組;而β-catenin的mrna表達(dá)量在大孔徑硅膠膜組最高,小孔徑硅膠膜組次之,極大孔徑硅膠膜組和無孔硅膠膜組表達(dá)最低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;3.4wb檢測了wnt/β-catenin信號通路的表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)大孔徑硅膠膜組的wnt3a和β-catenin的蛋白表達(dá)量較其余三組高(*p0.05,n=3),p-gsk-3β表達(dá)量,p-gsk-3β/gsk-3β比值和pcna的蛋白表達(dá)量在接種至大孔徑硅膠膜上的細(xì)胞中也最高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。gsk-3β的蛋白表達(dá)量無差異(p=ns,n=3)。axin的蛋白表達(dá)量則在大孔徑硅膠膜組中表達(dá)最低,其余三組間無差異;3.5加入wnt/β-catenin信號通路抑制劑xav939后,cck8法檢測大孔徑硅膠膜組細(xì)胞增殖情況發(fā)現(xiàn),與未加抑制劑組相比,細(xì)胞生長受到顯著抑制;同時(shí),wb檢測wnt/β-catenin信號通路的表達(dá)變化發(fā)現(xiàn),wnt3a,β-catenin和pcna的表達(dá)也都受到抑制,而axin2的表達(dá)量上升,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;3.6通過檢測接種到不同硅膠膜上的細(xì)胞的細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn),接種后一天,極大孔徑硅膠膜和大孔徑硅膠膜上粘附生長的細(xì)胞中處于細(xì)胞周期s期的比例分別為30.80%和31.62%,顯著大于小孔徑和無孔硅膠膜組的比例(分別為21.32%和23.41%,*p0.05,n=3)。接種后3天,大孔徑硅膠膜上粘附生長的細(xì)胞中處于細(xì)胞周期s期的比例仍顯著高于無孔硅膠膜組(*p0.05,n=3);4.不同孔徑結(jié)構(gòu)的硅膠膜對創(chuàng)面愈合的影響4.1小鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面愈合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),傷后3天,極大孔徑、大孔徑、小孔徑和無孔硅膠膜組的愈合率分別為40.28%,63.87%,56.85%和28.24%,傷后7天創(chuàng)面愈合率分別為63.42%,89.25%,68.59%和67.28%。傷后3、7天大孔徑硅膠膜組的創(chuàng)面愈合率均顯著大于其余三組(**p0.01,n=5);4.2同時(shí),傷后3天四組的平均創(chuàng)面收縮率分別為36.30%,60.09%,51.78%和24.67%,大孔徑硅膠膜組的收縮率顯著大于其余三組(*p0.05,n=5)。而傷后7天的平均創(chuàng)面收縮率則分別為52.35%,56.58%,55.23%和57.93%,各組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=ns,n=5);4.3對病理切片分析發(fā)現(xiàn),傷后3天各組新生上皮長度無差異。而傷后7天,極大孔徑、大孔徑、小孔徑和無孔硅膠膜組創(chuàng)面新生上皮長度分別為761.9μm,1173.78μm,825.13μm和656.61μm,大孔徑硅膠膜組新生上皮長度顯著長于其余各組(**p0.01,n=5);4.4通過免疫組化和wb來檢測組織中wnt3a,β-catenin和pcna的表達(dá)。其中組化發(fā)現(xiàn)wnt3a在大孔徑硅膠膜組創(chuàng)緣組織中呈明顯的陽性深染,wb結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了其表達(dá)量顯著高于極大孔徑、小孔徑和無孔硅膠膜組(*p0.05,n=3);大孔徑硅膠膜組創(chuàng)緣組織中β-catenin的表達(dá)量也高于小孔徑和無孔硅膠膜組(*p0.05,n=3);pcna陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)和wb檢測都證實(shí)了增殖標(biāo)記物pcna在大孔徑硅膠膜組中的表達(dá)量是所有組別中最高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;5.雙層復(fù)合硅橡膠仿生敷料的構(gòu)建及其生物學(xué)測試5.1通過超景深顯微鏡觀察雙層硅膠膜的結(jié)構(gòu)可以發(fā)現(xiàn),復(fù)合硅橡膠仿生敷料明顯的分為兩層結(jié)構(gòu),其中上層厚度:0.5±0.15mm,孔徑大小:1.12±0.25μm;下層厚度:1.2±0.5mm,孔徑大小:135.91±30.75μm;5.2經(jīng)檢測,雙層硅膠膜力學(xué)性能優(yōu)異(楊氏模量:0.16mpa,斷裂伸長率:2427.64%),同時(shí)具有合適的水蒸氣透過率(watervaportransmissionrate,wvtr,229.10g/m2/天),適宜應(yīng)用于創(chuàng)面;5.3皮下包埋實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),雙層硅膠膜皮下包埋后刺激產(chǎn)生的纖維囊厚度和凡士林紗布刺激產(chǎn)生的纖維囊厚度無差異,生物相容性較好;5.4創(chuàng)面愈合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與對照組、凡士林紗布組和無孔硅膠膜組相比,雙層硅膠膜能顯著加速創(chuàng)面的愈合,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(**p0.01,n=5);5.5對病理切片的分析也同樣發(fā)現(xiàn)雙層硅膠膜可以顯著促進(jìn)創(chuàng)面新生上皮的生長和肉芽組織的形成;5.6通過對pcna和cd31的免疫組化染色,對創(chuàng)緣pcna陽性細(xì)胞和創(chuàng)面血管計(jì)數(shù)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),雙層硅膠膜的使用可以促進(jìn)創(chuàng)緣細(xì)胞的增殖,以及創(chuàng)面的血管化;5.7通過對e-cadherin的免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),雙層硅膠膜的使用可以下調(diào)創(chuàng)緣表皮細(xì)胞間e-cadherin的表達(dá),從而促進(jìn)細(xì)胞遷移。結(jié)論總結(jié)本課題,可得到以下的結(jié)論:1.我們通過溶劑揮發(fā)誘導(dǎo)的相分離法成功制備了具有不同微孔結(jié)構(gòu)的硅膠膜,其中孔徑結(jié)構(gòu)的形成是由于溶劑揮發(fā)導(dǎo)致了液體石蠟和液體硅橡膠的相分離,從而在硅橡膠內(nèi)部形成液體石蠟珠滴,最后除去液體石蠟珠滴后便形成多孔硅橡膠膜;使用該方法制得的多微孔硅膠膜具有孔徑尺寸可控、工藝簡單、能耗低、成本低的優(yōu)點(diǎn);2.硅膠膜的不同孔徑結(jié)構(gòu)對于阻擋細(xì)菌入侵有著重要作用。其中小孔徑結(jié)構(gòu)(平均孔徑:5.27μm)更利于阻擋細(xì)菌入侵,防止創(chuàng)面感染;3.硅膠膜的不同孔徑結(jié)構(gòu)對于細(xì)胞增殖有著重要影響,其中大孔徑結(jié)構(gòu)(平均孔徑:110.47μm)的微孔硅膠膜最有利于細(xì)胞的粘附增殖。wnt/β-catenin信號通路參與了孔徑對細(xì)胞增殖的調(diào)控;4.在體實(shí)驗(yàn)證實(shí)了大孔徑結(jié)構(gòu)的硅膠膜(平均孔徑:110.47μm)利于創(chuàng)面的再生和修復(fù),而110.47μm可能是硅橡膠材料制備創(chuàng)面敷料用于創(chuàng)面治療的最適孔徑;5.最后根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在國內(nèi)外研究中首次利用硅橡膠材料成功構(gòu)建了上層小孔徑,下層大孔徑結(jié)構(gòu)的雙層仿生敷料。其上層較小孔徑結(jié)構(gòu)具備防止細(xì)菌入侵的屏障作用,下層的大孔徑結(jié)構(gòu)則利于創(chuàng)面細(xì)胞的增殖和修復(fù)。雙層硅橡膠敷料整體則具備良好的理化性能和生物相容性,可以有效地保護(hù)創(chuàng)面并維持創(chuàng)面局部良好的微環(huán)境,從而最終促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)。上述對材料的孔徑結(jié)構(gòu)對創(chuàng)面愈合的影響及其機(jī)制的研究,以及在此基礎(chǔ)上構(gòu)建出的新型硅橡膠敷料,為臨床創(chuàng)面的治療提供了新的手段和思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R641;R318.08

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本文編號：1737466