本文選題：間充質干細胞　切入點：微泡　出處：《華中科技大學》2016年博士論文

【摘要】：第一部分骨髓間充質干細胞來源微泡的生物學特征目的：研究骨髓來源MSC-MV的形態(tài)、大小和免疫表型等基本生物學特征以及其內包含的miRNA的表達情況,為今后研究MSC-MV的生物學效應和臨床應用潛能奠定基礎。方法：培養(yǎng)大鼠骨髓來源MSC并對其進行鑒定：收集MSC條件培養(yǎng)上清,采用梯度離心方法分離提取MSC-MV;掃描電鏡及激光共聚焦顯微鏡觀察MSC-MV的形態(tài)及大�。和ㄟ^流式細胞術檢測MSC-MV膜表面是否表達MSC特征性表面標志;采用蛋白定量方法比較MSC在應激條件下釋放MV的量;miRNA芯片檢測MSC-MV內miRNA總體表達水平,通過生物信息學方法了解MSC-MV內miRNA主要參與的生物學過程。結果：我們通過全骨髓貼壁法培養(yǎng)的大鼠骨髓來源MSC表面表達MSC的經(jīng)典表面標志,并在體外具有成骨、成脂和成軟骨分化能力。通過梯度離心方法,我們分離提取了MSC條件培養(yǎng)上清中的MV,掃描電鏡和激光共聚焦顯微鏡檢測提示MSC-MV為類球形,直徑在100-1000 nm范圍之間,并且流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)MSC-MV表面表達MSC的經(jīng)典表面標志,說明其能反映母體細胞的膜表面特征。此外,我們還發(fā)現(xiàn)MSC在無血清應激條件下釋放的MV的量高于正常培養(yǎng)條件下所釋放的量,進一步說明細胞在應激條件下釋放的MV會增多。最后,我們采用miRNA芯片方法檢測MSC-MV內miRNA的表達情況,發(fā)現(xiàn)MSC-MV內包含274種已知的大鼠miRNA,并且這些miRNA參與了多種生物學進程的調控,例如轉錄調控、細胞內信號級聯(lián)等等。同時,我們通過查閱文獻,發(fā)現(xiàn)MSC-MV內包含許多miRNA參與調控干細胞分化、血管新生、造血功能、免疫反應等。結論：骨髓來源MSC在體外培養(yǎng)過程中能產(chǎn)生大量MV,這些MSC-MV大小在100-1000 nm之間,表達其母體細胞的特征性標志,并包含多種miRNA,參與調控多種生物學進程。第二部分：骨髓間充質干細胞來源微泡的體外生物學效應目的：骨組織工程應用中,種子細胞在植入體內后常常由于無法及時建立血供易發(fā)生凋亡,基于以往文獻報道過的其他種屬及組織來源MSC-MV的生物學效應,本部分研究擬從血管新生、抗凋亡以及成骨分化三個方面研究大鼠骨髓來源MSC-MV的體外生物學效應。方法：我們以大鼠骨髓來源MSC-MV為研究對象,在體外將MSC-MV與人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)共同孵育,通過CCK-8檢測、劃痕實驗和matrigel成管實驗等方法研究MSC-MV對HUVEC增殖、遷移和成血管能力的影響。此外,我們在體外通過無血清、低氧培養(yǎng)條件模擬種子細胞植入體內后所處的缺血缺氧環(huán)境,將MSC-MV與低氧無血清誘導凋亡的MSC共同孵育,通過TUNEL和qRT-PCR方法檢測MSC-MV對誘導凋亡的MSC是否具有抗凋亡效應。同時,我們在體外將MSC-MV分別與成骨誘導和未誘導的MSC共同孵育,通過茜素紅半定量和qRT-PCR方法檢測MSC-MV對MSC自身成骨分化能力的影響。結果：MSC-MV在體外能促進]HUVEC的增殖、遷移和matrigrl成管能力,并且該效應隨MSC-MV濃度上升而增強。此外,我們證明低氧無血清培養(yǎng)能誘導MSC凋亡,而MSC-MV不能減少低氧無血清培養(yǎng)狀態(tài)下的MSC凋亡細胞數(shù),且對MSC凋亡相關基因的表達水平無顯著影響。同時,我們還證明MSC-MV不能增強MSC自身的成骨分化能力,并且對MSC成骨相關基因的表達水平無明顯影響。結論：大鼠骨髓來源MSC-MV在體外對內皮細胞具有促血管新生效應,對低氧無血清誘導凋亡的MSC無抗凋亡效應,且對MSC自身成骨分化能力無顯著影響,為進一步研究MSC-MV在骨組織工程領域的應用潛能奠定基礎。第三部分：骨髓間充質干細胞來源微泡在骨組織工程中的應用潛能目的：我們推測MSC-MV能通過促進血管新而提高組織工程骨移植物的骨再生能力。種子細胞、構建方式和生物材料是骨組織工程技術的三個重要因素,我們擬從構建方式和生物材料兩方面研究探討骨髓MSC-MV在骨組織工程應用中的潛能。方法：從構建方式出發(fā),從我們利用藻酸鈉凝膠包裹MSC-MV以及成骨誘導后的MSC接種于聚己內酯(PCL)支架材料上,構建了一種細胞+MV+生物材料復合物。從生物材料角度出發(fā),我們利用MSC-MV包被生物材料脫鈣骨基質(DBM),制備MV復合生物材料。我們在體外通過相差顯微鏡、掃描電鏡和激光共聚焦顯微鏡研究細胞+MV+生物材料復合物和MV復合生物材料的生物學特征。并分別將制備好的細胞+MV+物材料復合物和接種了種子細胞的MV復合生物材料以及相應對照組植入裸鼠皮下異位成骨模型中,通過小動物CT、蘇木素-伊紅染色和CD31免疫組化染色等方法研究MSC-MV在體內是否能促進血管新生及骨組織再生。結果：我們發(fā)現(xiàn),通過藻酸鈉凝膠包裹的方式能使種子細胞均勻的分布于細胞+MV+生物材料復合物中,并且我們所制備的MV復合生物材料上,MV能均勻分布于生物材料上且保持膜結構完整。我們進一步將細胞+MV+生物材料復合物及MV復合生物材料植入裸鼠皮下異位成骨模型,結果顯示MSC-MV在體內能促進血管新生及骨組織再生。結論：我們首次利用MSC-MV構建了細胞+MV+生物材料復合物,并制備了MSC-MV復合生物材料。我們還通過體內實驗證明,以上兩種方式能將MSC-MV成功應用于骨組織工程技術,并且MSC-MV在體內能促進骨再生和血管化。我們的研究提示,MSC-MV在骨組織工程領域具有巨大的應用潛能。
[Abstract]:Objective : To study the biological effects of MSC - MV on MSC - MV by gradient centrifugation , and to investigate the biological effects of MSC - MV on MSC - MV . In vitro , MSC - MV was incubated with human umbilical vein endothelial cells ( HUVEC ) to study the effects of MSC - MV on proliferation , migration and angiogenesis in vitro .

【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R68;R318.08

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本文編號：1726071