本文選題：卵巢組織　切入點(diǎn)：DMSO　出處：《鄭州大學(xué)》2013年博士論文

【摘要】：近年來(lái),隨著社會(huì)的發(fā)展,生活水平的提高,人們對(duì)自身健康及生殖質(zhì)量日益關(guān)注,對(duì)生殖能力的保存提出了越來(lái)越高的要求,由此極大地促進(jìn)了學(xué)者們對(duì)人類卵巢組織凍存技術(shù)的研究和臨床應(yīng)用的探索。2008年,WHO調(diào)查發(fā)現(xiàn)140萬(wàn)例新增腫瘤患者中近70萬(wàn)是女性,40歲育齡婦女占8%。放、化療及手術(shù)等治療有效地治療了患者的疾病并延長(zhǎng)了生命,但大劑量放療、化療和卵巢手術(shù)可導(dǎo)致年輕女性生殖力的喪失。保存女性生殖能力的方法有：取卵并行體外受精后胚胎冷凍、取卵后卵子冷凍、卵巢組織冷凍。因胚胎冷凍及卵子冷凍需要進(jìn)行促排卵、取卵等較長(zhǎng)周期的治療,影響和延誤惡性腫瘤患者的治療,且只適用于已婚女性,因此應(yīng)用受到限制。而卵巢組織冷凍保存不需要對(duì)卵巢進(jìn)行藥物刺激促排卵,在手術(shù)及化療前直接切除卵巢組織進(jìn)行冷凍,不影響患者自身原有惡性腫瘤及疾病的化療及放療,對(duì)女性生育儲(chǔ)備的生殖內(nèi)分泌功能保存有著重要的意義,為此類患者提供了一種補(bǔ)償方法。20世紀(jì)50年代初,Parkes將大鼠卵巢組織切片慢速冷凍保存于-79℃的甘油鹽水混合液中,快速解凍復(fù)蘇后自體移植,之后觀察到移植的卵巢組織出現(xiàn)卵泡生長(zhǎng)發(fā)育,大鼠恢復(fù)了內(nèi)分泌功能。20世紀(jì)90年代,卵巢組織冷凍隨著冷凍科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和改進(jìn)以及各種抗凍劑的出現(xiàn),發(fā)展非常迅速,不斷有小鼠、綿羊和非人類哺乳類動(dòng)物卵巢組織冷凍實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道,并有凍融卵巢組織移植成功的案例。綿羊與人類卵巢無(wú)論是卵巢組織結(jié)構(gòu)及排卵周期均較為相似,因此綿羊卵巢組織凍融并移植后獲得成功的妊娠,為人類卵巢組織凍融技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用提供了有意義的模型,并奠定了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。Donnez J在腹腔鏡下對(duì)一例何杰金氏患者自體原位移植了凍存6年的卵巢組織,隨訪發(fā)現(xiàn)該患者術(shù)后半年就恢復(fù)了月‘經(jīng)周期,并有周期性排卵及黃體生成,術(shù)后11個(gè)月HCG測(cè)定和B超證實(shí)患者成功妊娠,并順利分娩。我國(guó)開(kāi)展卵巢組織冷凍技術(shù)還處于摸索階段,陳子江等研究冷凍人卵巢皮質(zhì),觀察卵巢皮質(zhì)內(nèi)各級(jí)卵泡形態(tài)及卵巢組織體外培養(yǎng)獲得了一定的經(jīng)驗(yàn)。 卵巢組織冷凍保存的優(yōu)勢(shì)在于其可冷凍卵巢皮質(zhì)原位未成熟的始基卵泡,因其具有相對(duì)靜止、體積小、缺乏透明帶及皮質(zhì)顆粒的特性,容易耐受冷凍及復(fù)蘇造成的損傷,成功的卵巢組織冷凍和復(fù)蘇,可保存卵巢組織中大量結(jié)構(gòu)完整、具有生存活力及發(fā)育能力的原始卵泡,從而開(kāi)辟了一條卵巢早衰和惡性腫瘤患者的治療新途徑。有效的卵巢冷凍保存及復(fù)蘇技術(shù)是建立卵子庫(kù)的基本前提,復(fù)蘇后卵巢組織的成功移植對(duì)女性生育力的保存及恢復(fù)具有重要意義。為了拯救面臨威脅和瀕危動(dòng)物,保存基因多樣性,世界各地基因組儲(chǔ)存中心正在收集和冷凍來(lái)自這些動(dòng)物的卵巢組織。 卵巢冷凍保存及復(fù)蘇還存在許多有待解決的問(wèn)題,雖然在鼠類和大型靈長(zhǎng)類動(dòng)物中卵巢組織冷凍保存技術(shù)已有后代出生并獲得了階段性的研究成果,但用于人類卵巢組織的冷凍保存及復(fù)蘇移植技術(shù)還存在許多問(wèn)題,難以充分有效地的運(yùn)用于臨床,其關(guān)鍵難點(diǎn)包括確立最適宜的卵巢組織冷凍保存方案,因?yàn)槔鋬鲞^(guò)程中各個(gè)環(huán)節(jié)均有許多因素會(huì)影響卵巢組織的凍融效果,如組織切塊的大小,所選擇的冷凍方法、冷凍保護(hù)劑的種類及濃度、冷凍和復(fù)蘇過(guò)程、操作人員的技術(shù)水平、硬件設(shè)備條件等,目前尚無(wú)定論的減少冷凍損傷的最佳冷凍方案。 卵巢組織復(fù)蘇移植后的成活情況是決定生殖能力能否恢復(fù)的關(guān)鍵。影響移植成功的因素有很多,首先是移植后局部灌注損傷：Aubard等學(xué)者在羊卵巢組織自體移植模型實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),只有5%的原始卵泡在移植后能夠存活,分析原因可能是移植后的卵巢未行血管吻合,自身無(wú)血供,而移植局部的血管再生至少需要48小時(shí),在此期間由于血供不足可能對(duì)卵巢造成了不可逆的損傷,如何保護(hù)移植組織不受缺血缺氧損害是卵巢組織凍融后移植亟待解決的一個(gè)問(wèn)題；其次是最適宜移植部位的確立：迄今為止,國(guó)內(nèi)外研究尚無(wú)最適宜卵巢組織移植的最佳部位定論,但能確認(rèn)的是最適宜的移植部位必須具備能為組織的植入和成活發(fā)育提供良好條件、并且方便卵泡的檢測(cè)和穿刺取卵的部位；最后是卵巢組織同種自體移植后的安全性問(wèn)題的解決：卵巢組織的冷凍和移植的不斷進(jìn)步,為癌癥患者恢復(fù)其自身卵巢功能和保存生育能力帶來(lái)了新的希望。但卵巢組織移植仍然存在著一定的風(fēng)險(xiǎn)。凍融卵巢組織同種移植多數(shù)是為了對(duì)惡性腫瘤患者的生育能力進(jìn)行保存,因此有學(xué)者質(zhì)疑,移植惡性腫瘤患者的冷凍卵巢組織中是否存在微小癌灶,從而導(dǎo)致移植后腫瘤細(xì)胞發(fā)生播散或者再?gòu)?fù)發(fā)。MuellerA等實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)大鼠卵巢經(jīng)同種異位移植后,發(fā)生性索間質(zhì)瘤的幾率達(dá)100%。關(guān)于移植組織安全性的監(jiān)測(cè),Dror等研究表明采用RT-PCR(?)邕夠敏感的檢測(cè)到癌癥患者卵巢組織內(nèi)殘存的微小病灶,從而提高移植的安全性。因此,在決定移植前,采用先進(jìn)的檢測(cè)手段如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR、FISH、基因芯片等技術(shù),檢測(cè)移植卵巢組織內(nèi)殘存的微小病灶,以降低卵巢移植所帶來(lái)的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn),有利于提高卵巢組織移植的有效性和安全性。 關(guān)于卵巢組織冷凍、復(fù)蘇、移植研究所采用的標(biāo)本,人類卵巢組織凍存研究標(biāo)本大多來(lái)自于因卵巢疾患而需要進(jìn)行婦科手術(shù)的病人,由于她們年齡一般都比較大,卵巢中某些區(qū)域整群卵泡已經(jīng)耗盡,同時(shí)合并有子宮內(nèi)膜異位囊腫等卵巢病變,所以很難獲得足夠數(shù)量的卵泡標(biāo)本,而且人類卵巢組織的冷凍、復(fù)蘇、移植涉及諸多倫理問(wèn)題,所以實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的獲得非常珍貴而有限,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不夠充沛。有研究顯示種屬間卵巢原始卵泡沒(méi)有明顯差異,本實(shí)驗(yàn)前期選擇家兔卵巢組織來(lái)進(jìn)行研究,是由于其低廉的價(jià)格,廣闊的來(lái)源,較短的繁殖周期,且人類與家兔卵巢始基卵泡中卵母細(xì)胞的大小及進(jìn)入減數(shù)分裂的卵母細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)基本相似。在前期家兔卵巢凍存研究基礎(chǔ)上,我們又對(duì)來(lái)自卵巢手術(shù)剝離的人類卵巢組織標(biāo)本進(jìn)行了冷凍、復(fù)蘇和移植的研究。 本研究分四個(gè)部分,即家兔卵巢組織冷凍復(fù)蘇的實(shí)驗(yàn)研究、家兔卵巢組織異種異位移植的實(shí)驗(yàn)研究、人卵巢組織冷凍復(fù)蘇的實(shí)驗(yàn)研究、人卵巢組織異種異位移植的實(shí)驗(yàn)研究四個(gè)階段。通過(guò)采用不同冷凍程序(慢速程序化法、快速玻璃化法)、不同冷凍載體(麥管法、微滴法、堅(jiān)硬表面法)、不同冷凍試劑及配伍方法(二甲基亞砜DMSO、乙二醇EG、丙二醇PROH)等分別對(duì)家兔及人卵巢組織進(jìn)行了冷凍、復(fù)蘇、體外培養(yǎng)、異體移植的系統(tǒng)研究,以期尋找適宜的卵巢組織冷凍復(fù)蘇方案及移植部位,為臨床開(kāi)展人類卵巢組織冷凍及移植提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)參考,為建立卵巢組織冷凍庫(kù)奠定基礎(chǔ)。 第一部分：家兔卵巢組織冷凍復(fù)蘇的實(shí)驗(yàn)研究 研究目的 采用不同冷凍保護(hù)劑(PROH、DMSO及EG)單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用于程序化或玻璃化法對(duì)家兔卵巢組織進(jìn)行冷凍并復(fù)蘇,觀察復(fù)蘇后卵巢組織中各級(jí)卵泡形態(tài)、卵巢組織Ⅱ型跨膜酪氨酸激酶受體(c-kit)和增殖細(xì)胞核抗原(ki67)以及主要組織相容性復(fù)合體類抗原(MHC-2)表達(dá)的變化,從而判斷各種冷凍方案對(duì)家兔卵巢組織形態(tài)學(xué)、細(xì)胞增殖活性、卵巢組織抗原性的影響,以探討相對(duì)適用于卵巢組織的冷凍復(fù)蘇方案。 研究方法及結(jié)果 1四種不同冷凍復(fù)蘇方法對(duì)家兔卵巢組織形態(tài)學(xué)的影響 1.1研究對(duì)象及分組：選擇清潔級(jí)性成熟雌性日本大耳白兔12只,隨機(jī)分為四組,麻醉后開(kāi)腹取其卵巢組織并切成lxlxlmm3塊,按隨機(jī)方法分組將家兔卵巢組織塊分別進(jìn)行慢速程序化(分A2及B2兩個(gè)亞組,冷凍劑分別采用PROH、 DMSO)及快速玻璃化(分C2及D2兩個(gè)亞組,冷凍劑分別采用DMSO+PROH、 DMSO+EG)冷凍并復(fù)蘇；冷凍前每組各取少量新鮮卵巢組織塊做為對(duì)照組(A1、B1、C1、D1)。 1.2研究?jī)?nèi)容：通過(guò)卵巢組織學(xué)檢測(cè),觀察新鮮對(duì)照組及各冷凍復(fù)蘇組卵巢組織內(nèi)各級(jí)卵泡比例、形態(tài)結(jié)構(gòu)及正常形態(tài)率等變化。 1.3研究結(jié)果 1.3.1新鮮及冷凍復(fù)蘇家兔卵巢組織形態(tài)學(xué)特點(diǎn)：來(lái)自各組家兔的新鮮卵巢組織切片中,顯微鏡下共計(jì)數(shù)各級(jí)卵泡1236枚,其中始基卵泡所占比率(88.2%)及其正常形態(tài)率(91.4%)均最高,初級(jí)卵泡及次級(jí)卵泡比率分別為8.4%和3.4%；計(jì)數(shù)來(lái)自三組冷凍復(fù)蘇卵巢組織切片中的卵泡共954枚,其中始其卵泡857枚,占89.8%,初級(jí)卵泡占7.3%,次級(jí)卵泡僅占2.8%。 1.3.2采用不同冷凍程序和冷凍劑處理后家兔卵巢組織各級(jí)卵泡形態(tài)學(xué)的變化：冷凍組中,以PROH慢速程序化冷凍組始基卵泡的形態(tài)正常率最高,達(dá)80.1%,明顯高于DMSO程序化組(70.5%)及兩組玻璃化組(DMSO+PROH及DMSO+EG組分別為67.6%,69.7%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；將各冷凍組所觀察到的各級(jí)卵泡合并計(jì)算,其中始基卵泡形態(tài)正常率(72.7%),明顯高于初級(jí)卵泡的形態(tài)正常率(55.7%),因次級(jí)卵泡總數(shù)極少,所以未行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 1.3.3冷凍復(fù)蘇前后家兔卵巢組織結(jié)構(gòu)變化：鏡下觀察冷凍前家兔卵巢組織內(nèi)可見(jiàn)排裂規(guī)則的卵巢間質(zhì)細(xì)胞緊密包裹的各級(jí)卵泡。所有冷凍復(fù)蘇組卵巢組織均可見(jiàn)以初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡為主的受損情況,這些卵泡與周圍間質(zhì)細(xì)胞分離,但始基卵泡受影響較��；各冷凍組卵巢間質(zhì)細(xì)胞排裂紊亂、連接疏松,形成裂隙。 2程序化及玻璃化冷凍對(duì)家兔卵巢抗原性及卵泡細(xì)胞增殖活性的影響 2.1研究對(duì)象及分組：選擇9只4-5月齡清潔級(jí)性成熟雌性日本大耳白兔,隨機(jī)分為3組(新鮮對(duì)照組、PROH慢速程序化冷凍組、DMSO+EG'決速玻璃化冷凍組),獲取卵巢組織方法如前所述,切塊待用。 2.2研究?jī)?nèi)容 2.2.1家兔卵巢組織相容性抗原(MHC-2)的表達(dá)：應(yīng)用SP免疫組化法檢測(cè)上述新鮮組及經(jīng)兩種冷凍方法處理后家兔卵巢組織MHC-2抗原表達(dá)的變化,通過(guò)觀察MHC-2抗原的平均吸光度值,判斷冷凍對(duì)卵巢組織抗原性的影響。 2.2.2冷凍復(fù)蘇對(duì)各級(jí)卵泡細(xì)胞增殖活性的影響：分離新鮮對(duì)照組及冷凍復(fù)蘇組卵巢組織內(nèi)大、小卵泡(直徑分別為100-150μm及300-500μm),對(duì)其進(jìn)行體外培養(yǎng)后,采用3H標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷摻入試驗(yàn)(3H-TdR),移入液閃瓶中上機(jī)測(cè)其脈沖信號(hào)數(shù)(cpm),判斷冷凍復(fù)蘇對(duì)各級(jí)卵泡細(xì)胞增殖活性的影響。 2.3研究結(jié)果 2.3.1PROH程序化與DMSO+EG玻璃化冷凍法對(duì)家兔卵巢MHC-2表達(dá)的影響：免疫組化結(jié)果顯示MHC-2主要表達(dá)于卵巢間質(zhì)細(xì)胞和次級(jí)卵泡卵母細(xì)胞的胞膜,而始基卵泡及初級(jí)卵泡的卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞均無(wú)表達(dá)；玻璃化冷凍組較程序化組和新鮮對(duì)照組卵巢組織MHC-2抗原的平均吸光度值明顯降低；程序化組與新鮮對(duì)照組平均吸光度值無(wú)明顯差異。 2.3.2PROH程序化與DMSO+EG玻璃化冷凍法對(duì)家兔卵泡細(xì)胞增殖活性的影響：通過(guò)3H-TdR摻入試驗(yàn)檢測(cè)各組卵泡細(xì)胞增殖活性發(fā)現(xiàn),程序化及玻璃化冷凍組與新鮮卵巢組小卵泡的cpm值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而冷凍組大卵泡的cpm值明顯降低；兩冷凍組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.不同玻璃化冷凍載體對(duì)家兔卵巢組織c-kit和W67表達(dá)的影響 3.1研究對(duì)象及分組：選擇12只4-5月齡清潔級(jí)性成熟雌性日本大耳白兔,按是否冷凍及玻璃化冷凍所選擇的載體不同隨機(jī)分為4組：新鮮對(duì)照組(A組)、麥管法玻璃化冷凍組(B組)、微滴法玻璃化冷凍組(C組)、堅(jiān)硬表面法(SSV)玻璃化冷凍組(D組)。玻璃化冷凍試劑采用EG+DMSO;獲取家兔卵巢組織方法如前所述,將卵巢組織切塊待用。 3.2研究?jī)?nèi)容：通過(guò)對(duì)凍融卵巢組織的組織學(xué)觀察,并采用免疫組化法檢測(cè)凍融卵巢組織Ⅱ型跨膜酪氨酸激酶受體(c-kit)和增殖細(xì)胞核抗原(Ki67)表達(dá),判斷冷凍對(duì)卵巢組織增殖活性及發(fā)育潛能的影響。 3.3研究結(jié)果：采用免疫組化檢測(cè)家兔新鮮及凍融卵巢組織,結(jié)果顯示各級(jí)卵泡內(nèi)卵母細(xì)胞的胞膜和/或胞漿中ki67蛋白均出現(xiàn)呈棕黃或棕褐色的陽(yáng)性表達(dá)；與新鮮組相比較,經(jīng)麥管法、微滴法、SSV法冷凍處理后Ki67和c-kit陽(yáng)性率表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論 1. PROH慢速程序化冷凍方法用于家兔卵巢組織冷凍獲得了較高的始基卵泡正常形態(tài)率及細(xì)胞增殖活性,可能是一種較好的冷凍方法。 2.玻璃化方法雖使始基卵泡形態(tài)正常率降低,但也能使始基及初級(jí)卵泡卵母細(xì)胞保持良好的增殖活性,并可降低家兔卵巢組織抗原性,可能會(huì)減輕復(fù)蘇后卵巢組織移植的免疫排斥,加之該技術(shù)操作簡(jiǎn)便,費(fèi)用低廉,可能會(huì)有良好的應(yīng)用前景。 3.程序化冷凍及玻璃化冷凍對(duì)形態(tài)結(jié)構(gòu)完整的小卵泡細(xì)胞增殖活力影響不明顯,而大卵泡增殖活性明顯下降。 第二部分：家兔卵巢組織異體異位移植的實(shí)驗(yàn)研究 研究目的 在前期研究基礎(chǔ)上,選擇低濃度配伍比的DMSO+EG做為冷凍保護(hù)劑,玻璃化冷凍家兔卵巢組織,將新鮮及冷凍復(fù)蘇后卵巢組織塊分別移植于去勢(shì)裸鼠頸部皮下,觀察接受移植后裸鼠動(dòng)情周期、激素分泌、子宮形態(tài)變化及移植物變化,以評(píng)價(jià)冷凍效果。 研究方法 1研究對(duì)象及分組 選擇清潔級(jí)性成熟雌性日本大耳白兔4只,取其卵巢組織處理后切塊,分三組用于新鮮組織觀察、新鮮移植、冷凍復(fù)蘇移植；移植宿主采用8-10周齡的SPF級(jí)性成熟雌性Nu/Nu裸鼠36只,分4組(每組9只),除正常對(duì)照組外,其余三組均切除雙側(cè)卵巢去勢(shì),之后分別用于新鮮組織移植、凍融組織移植及去勢(shì)對(duì)照組。 2研究方法 2.1卵巢組織冷凍復(fù)蘇方法：采用低濃度比二甲基亞砜(DMSO)+乙二醇(EG)作為冷凍保護(hù)液,通過(guò)堅(jiān)硬表面銅塊(SSV)法對(duì)卵巢組織進(jìn)行玻璃化冷凍后快速?gòu)?fù)蘇。 2.2卵巢組織移植：麻醉裸鼠后,消毒并切開(kāi)裸鼠左側(cè)頸部皮膚,眼科鑷分別夾取新鮮或凍融家兔卵巢組織多點(diǎn)移植于頸部皮下,縫合并標(biāo)記移植部位。 2.3家兔卵巢組織冷凍復(fù)蘇后移植的效果評(píng)價(jià) 2.3.1裸鼠陰道脫落細(xì)胞學(xué)觀察：每天觀察各組裸鼠陰道涂片上皮細(xì)胞變化以判斷裸鼠動(dòng)情周期恢復(fù)及持續(xù)時(shí)間。 2.3.2裸鼠血中雌激素測(cè)定：全部正常對(duì)照組及部分移植組裸鼠有動(dòng)情周期出現(xiàn)；去勢(shì)未移植組無(wú)動(dòng)情周期。分別測(cè)定對(duì)照組、去勢(shì)組及移植后出現(xiàn)動(dòng)情周期的裸鼠血清雌激素(E2)水平,判定卵巢功能情況。 2.3.3裸鼠子宮形態(tài)學(xué)觀察及移植物觀察：移植35天后,切除各組裸鼠完整的子宮,分別于肉眼及鏡下觀察其形態(tài)學(xué)變化；切開(kāi)新鮮及冷凍卵巢移植組裸鼠頸部皮膚,取出移植物,進(jìn)行組織學(xué)觀察。 研究結(jié)果 1裸鼠動(dòng)情周期情況 正常對(duì)照組裸鼠全部有規(guī)律的動(dòng)情周期；新鮮移植組9個(gè)裸鼠中7個(gè)出現(xiàn)動(dòng)情周期,冷凍移植組9個(gè)中6個(gè)出現(xiàn)動(dòng)情周期,兩移植組裸鼠恢復(fù)動(dòng)情周期天數(shù)無(wú)差異,正常及移植組動(dòng)情周期持續(xù)天數(shù)無(wú)差異。 2裸鼠血中雌激素水平測(cè)定 測(cè)定全部出現(xiàn)動(dòng)情周期的裸鼠和去勢(shì)裸鼠血中E2水平,兩移植組恢復(fù)動(dòng)情周期的裸鼠血中E2水平與正常對(duì)照組無(wú)明顯差異,均明顯高于去勢(shì)組。 3裸鼠子宮形態(tài)學(xué)觀察 去勢(shì)組裸鼠子宮明顯有別于有動(dòng)情周期的裸鼠子宮,呈萎縮、蒼白狀,內(nèi)膜薄,腺體少,表面被覆立方或者單層扁平上皮細(xì)胞；而正常對(duì)照及移植組裸鼠子宮色澤紅潤(rùn)而有彈性,形態(tài)飽滿,內(nèi)膜厚且腺體粗大、量多,腺細(xì)胞胞漿豐富,內(nèi)膜表面被覆單層高柱狀或假?gòu)?fù)層上皮細(xì)胞。 4卵巢組織移植物形態(tài)學(xué)觀察 取出裸鼠頸部皮下移植物進(jìn)行觀察,新鮮移植組與冷凍移植組移植物肉眼可見(jiàn)大部分長(zhǎng)成淡黃色圓形或橢圓體,體積增大明顯,移植物柔軟,部分移植組織塊表面出現(xiàn)凹凸不平的串珠狀突起。存活的移植物鏡下可見(jiàn)毛細(xì)血管生成,皮質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)到各級(jí)卵泡及閉鎖卵泡。 結(jié)論 采用低濃度DMSO+EG玻璃化冷凍法能夠較好地保存卵巢組織的結(jié)構(gòu)和功能,新鮮及凍融后的家兔卵巢組織裸鼠異種異位移植后能夠存活,并具有內(nèi)分泌功能。 第三部分：人卵巢組織冷凍復(fù)蘇的實(shí)驗(yàn)研究 研究目的 以不同濃度配伍的DMSO+EG做為玻璃化冷凍保護(hù)劑,分別以麥管法、微滴法及SSV法對(duì)人卵巢組織進(jìn)行玻璃化冷凍,通過(guò)觀察冷凍前后人卵巢組織中卵泡形態(tài)學(xué)變化、細(xì)胞凋亡率檢測(cè)及復(fù)蘇后卵巢組織體外培養(yǎng)上清液E2測(cè)定,評(píng)價(jià)不同冷凍復(fù)蘇方案的效果。 研究方法 1研究對(duì)象 2008.7-12月共收集20例因卵巢疾病而行腹腔鏡手術(shù)的患者剝離的卵巢囊腫壁上殘留組織,利用患者手術(shù)切除的廢棄組織進(jìn)行研究,該研究通過(guò)倫理委員會(huì)審核,并經(jīng)患者知情同意。將收集到的卵巢組織切成約lxlxlmm3的組織塊待用。 2研究?jī)?nèi)容 2.1卵巢組織冷凍及復(fù)蘇：通過(guò)采用不同濃度的DMSO和EG制備兩組玻璃化試劑(低濃度Ⅰ組,高濃度Ⅱ組)。將卵巢組織塊分別在平衡液中和兩種玻璃化冷凍液中浸泡暴露一定的時(shí)間后,再分別將卵巢組織塊通過(guò)微滴法、麥管法和SSV法進(jìn)行玻璃化冷凍,快速?gòu)?fù)溫后進(jìn)行組織學(xué)檢查及體外培養(yǎng)。 2.2復(fù)蘇后人卵巢組織體外培養(yǎng)：定期收集組織培養(yǎng)上清液進(jìn)行E2測(cè)定,14d后撈出卵巢組織塊,固定染色行組織學(xué)檢測(cè)。 2.3人卵巢組織冷凍復(fù)蘇效果判斷： 2.3.1冷凍前后卵巢組織中卵泡形態(tài)學(xué)分析：在卵巢組織塊冷凍前后和體外培養(yǎng)14d后,觀察各組卵巢組織結(jié)構(gòu)及卵泡形態(tài)變化,計(jì)數(shù)正常形態(tài)和異常改變的卵泡比率,檢測(cè)卵巢皮質(zhì)內(nèi)卵泡密度與分布以及各級(jí)卵泡的比例變化。 2.3.2凍融卵巢組織各種細(xì)胞凋亡情況：采用DNA斷裂原位末端標(biāo)記法檢測(cè)(Tunel)試劑盒,從DNA水平上檢測(cè)凍融后卵巢組織內(nèi)各種細(xì)胞凋亡情況。 2.3.3卵巢組織體外培養(yǎng)上清液中雌二醇的檢測(cè)：每48小時(shí)采集卵巢組織體外培養(yǎng)上清液,離心后保存在-80℃的冰箱中,以RIA法測(cè)定上清液中E2水平。 結(jié)果 1冷凍前后人卵巢組織中卵泡形態(tài)及各級(jí)卵泡比例變化 DMSO+EG高濃度配伍Ⅱ組原始卵泡正常形態(tài)率(43.7%)較新鮮對(duì)照組(75.5%)及低濃度Ⅰ組(69.4%)明顯下降,三組間各級(jí)卵泡所占比例無(wú)明顯差異,均以始基卵泡比例最高。 2冷凍復(fù)蘇后人卵巢組織結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)變化 新鮮人卵巢組織間質(zhì)細(xì)胞排裂致密而規(guī)則,卵巢皮質(zhì)中間質(zhì)細(xì)胞緊密包裹各級(jí)卵泡。經(jīng)兩種不同配伍比例的玻璃化冷凍液處理并分別采用三種載體冷凍保存的人卵巢組織復(fù)蘇后對(duì)始基卵泡影響不明顯,但可見(jiàn)卵巢組織內(nèi)部分間質(zhì)細(xì)胞排列紊亂,疏松甚至出現(xiàn)分離。 3人卵巢組織各類細(xì)胞冷凍復(fù)蘇后凋亡情況 凍融后人卵巢組織中各級(jí)卵泡中都沒(méi)有出現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)的棕色或棕褐色凋亡細(xì)胞；而卵巢組織內(nèi)間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)發(fā)現(xiàn)有凋亡細(xì)胞。經(jīng)單因素方差分析,玻璃化冷凍各組卵巢組織內(nèi)間質(zhì)細(xì)胞凋亡率與新鮮對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4各冷凍組復(fù)蘇后卵巢組織體外培養(yǎng)液中E2的變化 低濃度配伍Ⅰ組各載體組卵巢組織培養(yǎng)液中E2的分泌水平均高于高濃度配伍組Ⅱ各載體組,其中SSV法載體間差異更顯著,而各冷凍組內(nèi)載體間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論 1.人卵巢組織內(nèi)始基卵泡對(duì)冷凍損傷的耐受性高于初級(jí)卵泡。 2.低濃度的冷凍保護(hù)劑配合SSV法玻璃化冷凍方案對(duì)保存人卵巢組織的效果較佳。 第四部分：人卵巢組織異種異位移植的實(shí)驗(yàn)研究 研究目的 在前期研究基礎(chǔ)上,采用低濃度比DMSO+EG做為冷凍保護(hù)劑,通過(guò)SSV法對(duì)人卵巢組織進(jìn)行玻璃化冷凍復(fù)蘇,并將人卵巢復(fù)蘇組織塊多點(diǎn)移植至去勢(shì)裸鼠頸部皮下,觀察接受移植的裸鼠陰道脫落細(xì)胞學(xué)、血E2分泌及子宮形態(tài)學(xué)變化,以判斷冷凍效果。 研究方法 1研究對(duì)象及分組 2009.11～2010.3,收集20例因卵巢疾病而行腹腔鏡手術(shù)的患者剝離的卵巢囊腫壁上殘留組織,利用患者手術(shù)切除的廢棄組織進(jìn)行冷凍復(fù)蘇及異體移植研究,并在短期內(nèi)處死移植裸鼠進(jìn)行觀察,對(duì)冷凍及移植效果進(jìn)行評(píng)價(jià),未對(duì)患者造成任何傷害,該研究通過(guò)倫理委員會(huì)審核,并經(jīng)患者知情同意。將收集到的卵巢組織切成約1×1×1mm3的小塊待用。移植宿主采用健康性成熟Nu/Nu裸鼠,按是否移植分為四組(正常對(duì)照組、新鮮移植組、凍存移植組、去勢(shì)組),后三組裸鼠切除雙側(cè)卵巢去勢(shì)。 2研究?jī)?nèi)容 2.1冷凍及復(fù)蘇：采用低濃度比DMSO+EG通過(guò)SSV法對(duì)卵巢組織進(jìn)行玻璃化冷凍,快速?gòu)?fù)溫法進(jìn)行復(fù)蘇。 2.2卵巢組織移植方法：分別將新鮮及凍融復(fù)蘇后人卵巢組織多點(diǎn)移植于相應(yīng)組別裸鼠左側(cè)頸部皮下。 2.3觀察指標(biāo)： 2.3.1裸鼠陰道脫落細(xì)胞學(xué)觀察：移植術(shù)后第5天起每日對(duì)裸鼠陰道細(xì)胞學(xué)檢測(cè)觀察動(dòng)情周期。 2.3.2裸鼠血雌激素水平測(cè)定：分別于動(dòng)情期采集移植組裸鼠血測(cè)定血清E2水平,判定卵巢功能情況；去勢(shì)裸鼠于處死前采血檢測(cè)。 2.3.3裸鼠子宮形態(tài)觀察及移植物收集：甲醛固定切除的各組裸鼠子宮,切片染色后于光鏡下觀察子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)的形態(tài)；切開(kāi)移植組裸鼠頸部移植部位尋找卵巢組織移植物。 結(jié)果 1移植后裸鼠動(dòng)情周期恢復(fù)情況 正常對(duì)照組陰道細(xì)胞呈持續(xù)規(guī)律的動(dòng)情周期性變化,新鮮移植組中4/9裸鼠恢復(fù)動(dòng)情周期,冷凍移植組3/9裸鼠恢復(fù)動(dòng)情周期；去勢(shì)組陰道有核上皮細(xì)胞和角化細(xì)胞逐漸消失,白細(xì)胞大量增加,脫落細(xì)胞未見(jiàn)周期性變化。新鮮移植組裸鼠首次恢復(fù)動(dòng)情周期時(shí)間[(19.0±1.6)d]稍早于冷凍移植裸鼠[(22.3±1.2)d],但兩組動(dòng)情周期持續(xù)天數(shù)[(5.0±0.8)、(5.8±1.2)d]與正常對(duì)照組[(4.8±0.7)d]比較,差異無(wú)顯著性意義。 2移植組裸鼠子宮形態(tài)學(xué)變化 移植組小鼠子宮增粗紅潤(rùn),彈性好,與正常對(duì)照組相似。移植組與正常組裸鼠子宮濕重明顯重于去勢(shì)對(duì)照組。光鏡下觀察,正常對(duì)照組及移植組裸鼠子宮內(nèi)膜間質(zhì)疏松,內(nèi)膜腺體粗大、量多,腺細(xì)胞呈高柱狀,胞漿豐富,有假?gòu)?fù)層上皮細(xì)胞。與之相反,去勢(shì)組裸鼠子宮變細(xì)變薄,外觀蒼白,內(nèi)膜萎縮變薄,間質(zhì)致密,腺體數(shù)量少,腺腔較小,腺細(xì)胞呈靜止期表現(xiàn)。 恢復(fù)動(dòng)情周期的移植組裸鼠雖有動(dòng)情周期出現(xiàn)并有與正常對(duì)照組相近的E2分泌水平,但頸部移植部位卻未尋找到明顯移植物。 3裸鼠血清平均E2水平 新鮮與冷凍移植組有動(dòng)情周期的裸鼠血清平均E2水平與正常對(duì)照組無(wú)明顯差異,均顯著高于去勢(shì)裸鼠組。 結(jié)論 1.采用低濃度比DMSO+EG冷凍劑SSV法玻璃化冷凍人卵巢組織,復(fù)蘇后行異體異位移植可獲得與新鮮卵巢組織移植相同的效果。 2.人卵巢組織異體異位裸鼠頸部皮下無(wú)血管吻合移植能夠存活并恢復(fù)裸鼠動(dòng)情周期及內(nèi)分泌功能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R318.52;R711.75

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本文編號(hào)：1718690