本文選題：組織工程　切入點(diǎn)：聚乙烯亞胺(PEI)　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2013年博士論文

【摘要】：背景 關(guān)節(jié)軟骨缺損臨床十分常見(jiàn)，但目前的治療方法，包括保守治療和關(guān)節(jié)清理術(shù)、自體或異體骨軟骨移植、人工關(guān)節(jié)置換術(shù)等均存在明顯的缺陷。組織工程技術(shù)的發(fā)展為再生修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損提供了新的治療策略。但是作為組織修復(fù)執(zhí)行者的種子細(xì)胞BMSCs移植后的在體遷徙分布、增殖及轉(zhuǎn)歸過(guò)程，目前尚無(wú)安全無(wú)創(chuàng)、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的監(jiān)測(cè)手段，因此難以明確外源性種子細(xì)胞在關(guān)節(jié)軟骨缺損再生修復(fù)中所扮演的角色。而新近的磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）在體示蹤磁標(biāo)記細(xì)胞技術(shù)為其提供了新思路。超順磁性氧化鐵顆粒（superparamagnetic iron oxide nanoparticle，SPIO），作為負(fù)性磁共振對(duì)比劑，用于標(biāo)記移植細(xì)胞后能夠在MRI下顯著性降低T2加權(quán)像的圖像信號(hào)，明顯地區(qū)分出外源性的標(biāo)記細(xì)胞與原位組織的未標(biāo)記細(xì)胞，從而間接的反映出外源性細(xì)胞的分布及遷移情況。但是對(duì)于BMSCs的標(biāo)記而言，攝取這些SPIO的能力相對(duì)較弱導(dǎo)致單位細(xì)胞載鐵量不足，且其分裂速度較快導(dǎo)致單位細(xì)胞的載鐵量被迅速稀釋，使現(xiàn)有的SPIO產(chǎn)品難以滿足長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)MR監(jiān)測(cè)BMSCs的影像對(duì)比劑要求，迫切需要一種能夠克服上述問(wèn)題的新型SPIO材料。 目的 本課題以我關(guān)節(jié)外科中心既往對(duì)組織工程軟骨的研究所獲得的重要進(jìn)展為基礎(chǔ)，查閱最新的國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，進(jìn)行新型可控降解性SPIO的制備、體外SPIO標(biāo)記骨髓MSCs適宜方法、磁標(biāo)記種子細(xì)胞生物相容性評(píng)價(jià)、MR成像在體示蹤磁標(biāo)記種子細(xì)胞的技術(shù)方法研究，并以綠色熒光蛋白細(xì)胞示蹤技術(shù)為對(duì)照，完成其組織工程技術(shù)修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損動(dòng)物實(shí)驗(yàn)應(yīng)用研究，以期延長(zhǎng)MR監(jiān)測(cè)移植種子細(xì)胞的時(shí)間，為在體示蹤組織工程關(guān)節(jié)軟骨種子細(xì)胞的分布、遷移及轉(zhuǎn)歸提供一種實(shí)時(shí)、安全、無(wú)創(chuàng)、有效的新技術(shù)，為組織工程軟骨相關(guān)產(chǎn)品的臨床應(yīng)用提供即時(shí)監(jiān)測(cè)及療效評(píng)定的方法。 方法 1．新型可控降解性超順磁性納米顆粒的研制 根據(jù)Sun等人的方法合成SPIO納米顆粒。采用乳液揮發(fā)法對(duì)制備出來(lái)的晶體Fe3O4核心使用PEI進(jìn)行表面修飾，制備出新型可控降解性的PEI/SPIO。采用掃描電鏡(Scanning Electronic Mieroseopy，SEM)、動(dòng)態(tài)光散射(Dynamichghtscattering，，DLS)檢測(cè)顆粒大小，通過(guò)磁感應(yīng)強(qiáng)度檢測(cè)、弛豫率檢測(cè)鑒定新合成顆粒的超順磁性和核磁應(yīng)用特征。 2．新型SPIO磁標(biāo)記關(guān)節(jié)軟骨組織工程種子細(xì)胞可行性研究 采用梯度離心法從豬骨髓中分離培養(yǎng)擴(kuò)增BMSCs，用不同濃度的PEI/SPIO(4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、12μg/ml)標(biāo)記第三代BMSCs，孵育時(shí)間為24h，以未標(biāo)記BMSCs為對(duì)照。透射電鏡檢查鑒定細(xì)胞內(nèi)的SPIO顆粒，普魯士染色測(cè)定其標(biāo)記率；原子吸光光譜儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鐵含量；胎盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞存活情況；MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖能力；磁標(biāo)記BMSCs在誘導(dǎo)液中培養(yǎng)3w，鑒別SPIO標(biāo)記BMSCs的成骨、成軟骨、成脂分化能力：分別進(jìn)行鈣結(jié)節(jié)-茜素紅染色、甲苯胺藍(lán)染色和II型膠原免疫組化染色、油紅-O染色。選擇3.0T MR掃描儀自旋回波加強(qiáng)序列（SET2*WI序列）分別對(duì)不同濃度SPIO(4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、12μg/ml)標(biāo)記的BMSCs按5×10~6、1×10~6、5×10~5、1×10~5、5×10~4、1×10~4、5×10~3細(xì)胞濃度進(jìn)行MR成像。 3．SPIO標(biāo)記的BMSCs修復(fù)豬膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的在體MRI示蹤研究 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇18只貴州小香豬，隨機(jī)分為3組，A組：缺損處移植SPIO、GFP雙標(biāo)記BMSCs＋I(xiàn)I型膠原凝膠復(fù)合物(n＝6)；B組：缺損處移植單純GFP標(biāo)記的BMSCs＋I(xiàn)I型膠原凝膠復(fù)合物(n＝6)；C組：缺損處不作任何處理(n＝6)。A組為實(shí)驗(yàn)組，B組為陽(yáng)性對(duì)照組，C組為空白對(duì)照組。建立膝關(guān)節(jié)股骨滑車軟骨缺損模型，將SPIO和GFP雙重標(biāo)記的BMSCs（A組）或單純GFP標(biāo)記的BMSCs（B組）與1ml II型膠原水凝膠混合體外制備組織工程軟骨，然后移植到動(dòng)物模型的軟骨損傷區(qū)，于術(shù)后4w、8w、12w及24w四個(gè)時(shí)相點(diǎn)應(yīng)用磁共振掃描，對(duì)膝關(guān)節(jié)軟骨缺損區(qū)SPIO標(biāo)記的BMSCs進(jìn)行監(jiān)測(cè)。24w后處死動(dòng)物，行普魯士藍(lán)染色、番紅-O染色、天狼猩紅染色及GFP觀察鑒定SPIO顆粒及對(duì)軟骨修復(fù)效果的影響。 結(jié)果 1．新型可控降解性超順磁性納米顆粒的研制 在有機(jī)相中熱分解乙酰丙酮鐵的方法合成Fe304磁性顆粒，掃描電子顯微鏡及動(dòng)態(tài)光散射檢測(cè)粒徑大小為15nm-20nm，經(jīng)X射線衍射儀檢測(cè)并與國(guó)際粉末衍射標(biāo)準(zhǔn)聯(lián)合會(huì)出版的PDF標(biāo)注卡片進(jìn)行比較，確定為四氧化三鐵晶體結(jié)構(gòu)。經(jīng)聚乙烯亞胺包被后制成粒徑大小為79±28nm，飽和磁化率為48emu/g，T2弛豫率為323Fe mM/s，表面正電荷40mv，溶液終濃度為1.3275mg/ml的PEI/SPIO溶液。 2．新型SPIO磁標(biāo)記關(guān)節(jié)軟骨組織工程種子細(xì)胞可行性研究 磁標(biāo)記細(xì)胞普魯士染色顯示細(xì)胞標(biāo)記率隨標(biāo)記濃度增加而增加，8μg/ml標(biāo)記時(shí)細(xì)胞標(biāo)記率達(dá)到(97.45±3.15）%，與10μg/ml、12μg/ml標(biāo)記時(shí)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；透射電鏡檢查顯示致密鐵顆粒主要分布于細(xì)胞胞漿內(nèi)；原子吸光光譜儀檢測(cè)顯示細(xì)胞內(nèi)鐵隨標(biāo)記濃度增加而增加，至8μg/ml時(shí)達(dá)到峰值，隨著SPIO濃度的繼續(xù)增加，細(xì)胞內(nèi)鐵反而下降；胎盼藍(lán)染色證實(shí)8μg/ml以下SPIO濃度標(biāo)記對(duì)BMSCs活性無(wú)明顯影響；MTT法繪制生長(zhǎng)曲線表明8μg/ml以下SPIO濃度標(biāo)記對(duì)BMSCs增殖能力無(wú)顯著影響；與未標(biāo)記BMSCs相比，適宜濃度的SPIO標(biāo)記的BMSCs的成骨分化、成軟骨分化及成脂肪分化潛能未受影響。體外3.0TMR掃描結(jié)果提示：5×10~6、1×10~6、5×10~5、1×10~5、5×10~4個(gè)標(biāo)記細(xì)胞低信號(hào)強(qiáng)度表現(xiàn)與未標(biāo)記細(xì)胞相比具有顯著性差異(P0.05)；信號(hào)強(qiáng)度衰減率（△SI）隨細(xì)胞濃度增加而增加，具有顯著性差異(P0.05)。 3．SPIO標(biāo)記的BMSCs修復(fù)豬膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的在體MRI示蹤 術(shù)后4w，A組MRI（SET2*WI序列）顯示軟骨缺損區(qū)域有明顯低信號(hào)改變，周圍的滑膜組織及關(guān)節(jié)間隙中未見(jiàn)類似低信號(hào)區(qū)域，B組缺損區(qū)域未見(jiàn)信號(hào)變化，C組見(jiàn)缺損區(qū)域軟骨下骨出現(xiàn)信號(hào)增高。術(shù)后8w，A組MRI顯示軟骨缺損區(qū)域低信號(hào)改變?nèi)暂^為明顯，周圍的滑膜組織及關(guān)節(jié)間隙中未發(fā)現(xiàn)類似低信號(hào)區(qū)域。術(shù)后12w軟骨缺損處低信號(hào)改變較4w和8w減弱，但與B組信號(hào)仍有顯著差異，周圍的滑膜組織及關(guān)節(jié)間隙中偶有發(fā)現(xiàn)類似低信號(hào)區(qū)域，C組軟骨下骨信號(hào)增高更加明顯。術(shù)后24w，A組MRI顯示軟骨缺損區(qū)域低信號(hào)改變程度明顯減弱，低信號(hào)范圍亦顯著縮小，B、C組較12w未見(jiàn)明顯信號(hào)變化。術(shù)后4w、8w、12w與24w軟骨缺損修復(fù)區(qū)SI值兩兩相比均有顯著性差異。大體及組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)：術(shù)后24w，A組及B組：為透明樣軟骨修復(fù)，表面平整，和周圍軟骨整合緊密、厚度相近，細(xì)胞密度稍大，A組缺損區(qū)域可見(jiàn)植入物內(nèi)散在普魯士藍(lán)染色陽(yáng)性細(xì)胞及大量GFP表達(dá)，兩者分布基本一致，B組可見(jiàn)GFP陽(yáng)性細(xì)胞，未見(jiàn)普魯士藍(lán)染色陽(yáng)性細(xì)胞；C組（空白對(duì)照組）：為纖維樣組織，表面毛糙，細(xì)胞外基質(zhì)排列紊亂。 結(jié)論 1．成功合成了新型可控降解性的聚乙烯亞胺包覆的SPIO，理化檢測(cè)結(jié)果表明，新材料具有良好的超順磁性和核磁應(yīng)用特征(飽和磁感應(yīng)強(qiáng)度和T2弛豫率)。 2．PEI/SPIO能直接標(biāo)記BMSCs，適宜濃度（"f8μg/ml）時(shí)磁標(biāo)記對(duì)細(xì)胞活性、增殖及成骨、成軟骨、成脂分化能力無(wú)明顯影響，標(biāo)記細(xì)胞在3.0TMR SET2*WI序列上能產(chǎn)生特征性的低信號(hào)改變，體外MRI示蹤PEI/SPIO標(biāo)記BMSCs方法可行，最低檢測(cè)閾值為5×104/cm~3。 3．PEI/SPIO標(biāo)記BMSCs移植至關(guān)節(jié)軟骨缺損區(qū)后可以在3.0TMR SET2*WI序列上產(chǎn)生特征性低信號(hào)改變至少24w；MRI體內(nèi)示蹤PEI/SPIO標(biāo)記BMSCs技術(shù)可實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)外源性BMSCs在活體膝關(guān)節(jié)軟骨區(qū)域內(nèi)的分布、遷移情況，為在體示蹤組織工程關(guān)節(jié)軟骨種子細(xì)胞的在體生物學(xué)行為提供一種實(shí)時(shí)、安全、無(wú)創(chuàng)、有效的新技術(shù)，為組織工程軟骨相關(guān)產(chǎn)品的臨床應(yīng)用提供即時(shí)監(jiān)測(cè)及療效評(píng)定的方法。
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【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R318.08

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1699071