本文選題：卵巢組織　切入點(diǎn)：常規(guī)玻璃化冷凍　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：隨著腫瘤綜合治療的進(jìn)步，年輕女性腫瘤患者的生存率得到了很大提高。但在治療癌癥的同時(shí)，也帶來(lái)了許多副作用，如卵巢早衰、正常卵巢的切除，喪失內(nèi)分泌及生育能力等等。由于部分患者處于生育年齡，如何保存生育能力成為亟待解決的問(wèn)題。 目前有三種方法來(lái)保存患者的生育能力：即胚胎冷凍，卵母細(xì)胞冷凍及卵巢組織冷凍。胚胎冷凍的只適用于已婚女性，而卵母細(xì)胞冷凍可用于單身女性，但妊娠率很低。而且這兩種技術(shù)操作過(guò)程復(fù)雜，且需長(zhǎng)時(shí)間促排卵及取卵，另外使用促排卵藥物會(huì)使血清雌激素水平升高，禁用與一些雌激素敏感性惡性腫瘤患者。而卵巢組織冷凍是未成年人及未婚女性的唯一選擇，因?yàn)檫@一方法不需要配偶，亦不需要促排卵藥物，可以在任何周期取材，尤其適合需要及時(shí)治療的腫瘤患者。 卵巢組織冷凍保存有三種方式：慢速程序化冷凍、常規(guī)玻璃化冷凍(conventional vitrification,CV)及直接覆蓋玻璃化冷凍法(direct covervitrification，DCV)。盡管慢速程序化冷凍卵巢組織取得了很大進(jìn)展，但其操作過(guò)程復(fù)雜，需要程序冷凍儀，費(fèi)用高。而常規(guī)玻璃化冷凍較之更為簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，冷凍效率更高，因而更為普遍。中國(guó)臺(tái)北Chen等報(bào)道的直接覆蓋玻璃化冷凍法，將小鼠卵巢組織與液氮直接接觸，進(jìn)行冷凍保存，該法降溫速率可達(dá)15000℃/min，冷凍效果優(yōu)于其他常規(guī)的玻璃化冷凍方法。但該方法目前研究尚少，也沒(méi)有展開應(yīng)用。 冷凍保存卵巢組織的目的為將卵巢組織移植回體內(nèi)，一定程度上恢復(fù)凍融卵巢組織的內(nèi)分泌及生育功能。然而在移植過(guò)程中，新生毛細(xì)血管形成前，會(huì)造成缺血再灌注損傷從而丟失大量卵泡�；谶@些，有人提出不同的策略以優(yōu)化移植結(jié)局，如移植較小的組織塊，或在移植前使用FSH、維生素E和VEGF來(lái)預(yù)處理動(dòng)物等，來(lái)提高移植物的生存率。 盡管卵巢組織的冷凍及移植已取得了一定的進(jìn)展，關(guān)于移植凍融卵巢組織目前國(guó)內(nèi)報(bào)道尚少見，也存在很多問(wèn)題亟待解決：①尋求最佳冷凍方案以減少冷凍及復(fù)蘇造成的損傷；②如何優(yōu)化移植方案，減少缺血-再灌注損傷，為移植的卵巢組織的生長(zhǎng)提供良好條件；③探討接受移植物功能恢復(fù)的時(shí)間及維持的時(shí)間；④探討卵巢癌患者自體移植卵巢組織的安全性；⑤移植的卵巢組織中卵子的發(fā)育及受精能力的探討；⑥接受卵巢組織移植的患者的社會(huì)心理因素以及對(duì)生活質(zhì)量的影響，等等。若這些問(wèn)題能夠一一解決，冷凍移植卵巢組織技術(shù)將能夠廣泛應(yīng)用于保存腫瘤患者的生殖及內(nèi)分泌功能，以提高女性患者的生活質(zhì)量。 本研究以雌性性成熟Wistar大鼠作為研究對(duì)象，比較常規(guī)玻璃化冷凍方法及直接覆蓋玻璃化冷凍方法對(duì)卵巢組織的影響，同時(shí)觀察FSH和VEGF在移植凍融卵巢組織過(guò)程中的作用，以期為優(yōu)化人類卵巢組織冷凍和移植提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一部分大鼠卵巢組織兩種玻璃化冷凍保存方案的比較研究 目的：本研究比較直接覆蓋玻璃化冷凍方法及常規(guī)玻璃化冷凍方法對(duì)大鼠卵巢組織的冷凍保存效果。 方法：將30只性成熟的Wistar大鼠隨機(jī)分為3組，每組10只：A組--新鮮對(duì)照組，B組--常規(guī)玻璃化冷凍組(conventional vitrification, CV)，C組--直接覆蓋玻璃化冷凍組(direct cover vitrification，DCV)。將各組大鼠雙側(cè)卵巢切除。B組，C組分別使用CV和DCV的方法冷凍保存。卵巢組織經(jīng)HE染色后，于光鏡下觀察新鮮及冷凍復(fù)蘇后原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡的形態(tài)，并計(jì)算每個(gè)切片中形態(tài)正常的各級(jí)卵泡的百分比，各級(jí)形態(tài)正常卵泡的百分比=(各級(jí)形態(tài)正常的卵泡個(gè)數(shù)/各級(jí)卵泡總個(gè)數(shù))×100%。為避免重復(fù)計(jì)數(shù)，卵泡計(jì)數(shù)以卵母細(xì)胞核為標(biāo)記。并用TUNEL法檢測(cè)各組卵巢組織中卵泡的凋亡率,卵母細(xì)胞核呈陽(yáng)性或超過(guò)50%的顆粒細(xì)胞為陽(yáng)性即判斷該卵泡凋亡。每個(gè)切片隨機(jī)抽取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)卵泡數(shù)（包括各級(jí)卵泡）。TUNEL陽(yáng)性率=(卵泡凋亡個(gè)數(shù)/卵泡總個(gè)數(shù))×100%。 結(jié)果： (1)新鮮組、CV組和DCV組中的正常形態(tài)原始卵泡的比例分別為93.61±1.66%,46.86±4.56%和90.93±1.84%；初級(jí)卵泡為89.14±2.62%,33.39±3.06%和73.17±4.53%；次級(jí)卵泡為：84.03±4.07%,25.31±4.57%和62.09±3.59%。CV組中各級(jí)卵泡的正常率均較新鮮組低(P0.05)，而DCV組中形態(tài)正常的原始卵泡的比例與新鮮組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。各組卵巢組織中正常形態(tài)卵泡的比例從原始卵泡、初級(jí)卵泡到次級(jí)卵泡呈遞減的趨勢(shì)。 (2)新鮮組、CV組和DCV組中TUNEL表達(dá)陽(yáng)性的所有卵泡比例分別為8.54±1.17%,40.31±3.87%,18.28±2.48%。與新鮮組相比經(jīng)兩種冷凍方式復(fù)蘇后的卵巢組織凋亡的卵泡均有增加(P0.05)，CV組中的凋亡率較DCV組更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論：直接覆蓋玻璃化冷凍法(DCV)比常規(guī)玻璃化冷凍法(CV)冷凍效率更高，可以有效的保存大鼠卵巢組織中的原始卵泡。 第二部分大鼠卵巢組織自體移植的實(shí)驗(yàn)研究 目的：建立大鼠卵巢組織自體移植模型，觀察新鮮卵巢組織和經(jīng)DCV冷凍復(fù)蘇后的卵巢組織經(jīng)異位移植后及移植后應(yīng)用FSH及VEGF，移植物的生長(zhǎng)情況，分析應(yīng)用FSH和VEGF對(duì)移植凍融大鼠卵巢組織的作用，為凍融的人類卵巢組織的移植提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： (1)將40只性成熟的Wistar大鼠隨機(jī)分為5組，A、B、C組各10只，D、E組各5只。A組為新鮮移植組，將卵巢組織切除后，將皮質(zhì)切為約2mm*2mm*4mm大小的小塊，立即移植于大鼠下肢肌肉中；B組卵巢組織經(jīng)DCV冷凍保存2周后，復(fù)蘇，自體異位移植于大鼠下肢內(nèi)側(cè)肌肉中，移植方法同上。C組，凍融方法同B組，于移植凍融的卵巢組織前2天開始每日注射FSH，5mIU/d；VEGF，20ng/d，術(shù)后繼續(xù)注射FSH，5mIU/d；VEGF，20ng/d，前后共7天；并設(shè)D組(去勢(shì)組)；E組(假手術(shù)組)為對(duì)照組。 (2)移植6周后，經(jīng)眼眶取血，用Elisa法檢測(cè)大鼠血清E2水平。 (3)取血后，斷頭法處死大鼠，收集卵巢組織，通過(guò)組織形態(tài)學(xué)觀察卵泡的形態(tài)及卵泡密度。隨機(jī)選取5個(gè)視野，在100倍視野下，用5mm×5mm網(wǎng)格微尺計(jì)數(shù)，計(jì)算每平方毫米內(nèi)卵泡的數(shù)量，即卵泡密度。 (4)檢測(cè)卵巢組織的增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)。當(dāng)核出現(xiàn)棕色時(shí)，視為PCNA蛋白表達(dá)陽(yáng)性，每個(gè)標(biāo)本取3張切片，每張切片隨機(jī)取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性卵泡的數(shù)量，計(jì)算PCNA蛋白表達(dá)率，PCNA陽(yáng)性卵泡率=(PCNA陽(yáng)性卵泡個(gè)數(shù)/卵泡總個(gè)數(shù))×100%。 (5)取出子宮稱重。 結(jié)果： (1) A、B、C、D、E組血清E2水平分別為59.61±6.85ng/L,28.38±8.47ng/L,58.99±8.63ng/L和2.59±1.19ng/L，79.56±12.07ng/L。A、B、C、E組的E2水平明顯高于D組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；A、B、C、D組E2水平低于E組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；A、C組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；而C組E2水平高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 (2) A、B、C、E組卵巢組織卵泡的密度分別為5.17±0.47n/mm3,2.07±0.28n/mm3,5.05±0.31n/mm3,7.75±0.38n/mm3。A、B、C組卵泡的密度低于E組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)，B組的卵泡密度低于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；A組與C組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 (3)凍融的卵巢組織移植回大鼠體內(nèi)后，A、B、C組及E組(假手術(shù)組)中卵巢組織各級(jí)卵泡均可見到PCNA(增值細(xì)胞核抗原)陽(yáng)性表達(dá)，A、B和C組的移植物中PCNA的陽(yáng)性率均較E組假手術(shù)組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），B組陽(yáng)性率低于A、C組，，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),A組與C組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 (4) A、B、C、D、E組子宮重量分別為1.39±0.09g，1.10±0.12g，1.36±0.10g,1.02±0.06g,1.45±0.05g。A,C組與E組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)，B組大鼠的子宮重量低于E組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論：經(jīng)DCV復(fù)蘇后的大鼠卵巢組織經(jīng)自體異位移植后，卵泡能存活并恢復(fù)內(nèi)分泌功能，VEGF及FSH的應(yīng)用有利于移植卵巢組織中卵泡的生長(zhǎng)。
[Abstract]:With the improvement of the comprehensive treatment of tumors , the survival rate of young female tumor patients has been greatly improved . However , in the treatment of cancer , there are many side effects , such as premature ovarian failure , excision of normal ovary , loss of endocrine and fertility , etc .

There are three methods to preserve the fertility of a patient : embryo freezing , oocyte freezing , and ovarian tissue freezing . The embryos are frozen only for married women , and oocytes are frozen for single women , but the pregnancy rate is low . The use of ovulation drugs increases serum estrogen levels , disables those associated with some estrogen - sensitive malignancies , and the use of ovulation drugs is the only option for minors and unmarried women .

There are three ways of freezing preservation of ovarian tissue : slow programmed freezing , conventional vitrification ( CV ) and direct coverage vitrification ( DCV ) . Although slow programming of frozen ovarian tissue has made great progress , its operation process is complicated , it needs program freezing instrument , and its cost is high . The conventional vitrification method is simpler , more economical and has higher freezing efficiency , so it is more common . The cooling rate can reach 15000 鈩

本文編號(hào)：1671892