本文選題：脈沖電磁場　切入點(diǎn)：多孔鈦合金　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：骨缺損常因腫瘤切除、骨折、感染或者骨退化疾病引起,其治療耗費(fèi)巨大的社會經(jīng)濟(jì)資源。盡管臨床上廣泛使用自體骨移植、異體骨移植等方法來解決缺失骨的替代問題,然而組織的可用性,捐贈部位的發(fā)病率或者免疫排斥反應(yīng)等問題依然極大限制了這些技術(shù)在臨床的廣泛使用。純鈦和摻雜釩或鎳等的鈦合金具有非常卓越的生物相容性和較強(qiáng)的抗腐蝕性,展現(xiàn)出了它們作為骨替代物—承重金屬植入體的優(yōu)越性。然而鈦或鈦合金植入體與骨組織的機(jī)械不匹配導(dǎo)致了“應(yīng)力屏蔽”效應(yīng),加速了骨吸收,這就增加了植入體松動(dòng)的風(fēng)險(xiǎn)。為最大限度的模擬自體骨,植入體可以采用與松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)相近的多孔形式,為營養(yǎng)物運(yùn)輸和代謝產(chǎn)物的傳送提供良好的多孔通道。然而以鈦為基底的材料具有生物惰性,很容易與自然骨以“機(jī)械鉚合”的形式結(jié)合而并非形成所希望的化學(xué)鍵的方式結(jié)合,這就會導(dǎo)致鈦或鈦合金植入體的骨整合不完全。目前這仍然是一項(xiàng)臨床的巨大挑戰(zhàn),骨整合不完全會導(dǎo)致早期的固定不穩(wěn),長期的植入體穩(wěn)定性降低,尤其是在骨質(zhì)疏松病人體內(nèi)。因此,尋找新的加速鈦或鈦合金植入體骨整合的方法,以提高修復(fù)效能、改善骨缺損,對臨床應(yīng)用意義重大。國內(nèi)外大量研究證實(shí)脈沖電磁場(PEMF)作為一種可供選擇的非侵入式物理治療手段,對一系列的骨相關(guān)疾病能產(chǎn)生令人滿意的治療效果,例如骨愈合、骨不連和骨關(guān)節(jié)炎等。一些體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)研究也證明了PEMF可以抑制骨鈣丟失,改善骨質(zhì)疏松動(dòng)物的骨質(zhì)量。關(guān)于PEMF改善骨質(zhì)疏松的效能也被一些臨床研究所證實(shí)。PEMF可有效促進(jìn)體外成骨細(xì)胞的增殖和礦化,并且抑制破骨細(xì)胞的生成。盡管PEMF展現(xiàn)出了如此眾多積極的效應(yīng),但是關(guān)于PEMF是否可以促進(jìn)骨缺損動(dòng)物體內(nèi)的骨長入多孔鈦合金(p Ti)植入體,加速p Ti的骨整合的問題,依然懸而未解。因此,在本研究中我們提出了“PEMF協(xié)同p Ti修復(fù)骨缺損”的新理念和新思路,旨在系統(tǒng)性地探索PEMF對p Ti在體內(nèi)和體外骨形成的生物效能方面的潛在影響。首先,我們進(jìn)行了體外較優(yōu)磁場參數(shù)的篩選,利用篩選出的參數(shù)進(jìn)行了體外PEMF對p Ti上成骨細(xì)胞活性和功能的影響及潛在分子機(jī)制的探究。其次,通過構(gòu)建兔長骨骨缺損實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,制備低彈性模量的p Ti,采用Micro-CT、形態(tài)學(xué)、形態(tài)計(jì)量學(xué)等參數(shù)系統(tǒng)性的評估了PEMF協(xié)同p Ti對長骨骨缺損的修復(fù)效果。此外我們對PEMF協(xié)同p Ti對體內(nèi)骨生成的分子作用機(jī)制也進(jìn)行了進(jìn)一步探究。本研究有望為臨床上提高p Ti的修復(fù)效率和修復(fù)質(zhì)量提供新策略,為加速p Ti的骨整合,促進(jìn)植入體的早期固定和增加其在體內(nèi)的長期穩(wěn)定性提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。整個(gè)研究主要分為以下四部分:第一部分:p Ti植入材料的制備及PEMF促成骨細(xì)胞活性的參數(shù)篩選背景:鈦合金屬于致密材料其彈性模量遠(yuǎn)高于松質(zhì)骨,因此,易導(dǎo)致植入體和其周圍自然骨形成“應(yīng)力屏蔽”,從而加速骨吸收,提高體內(nèi)植入體的松動(dòng)風(fēng)險(xiǎn)。將鈦合金制作成多孔結(jié)構(gòu),不僅與松質(zhì)骨在結(jié)構(gòu)上近似,而且為骨代謝、骨長入和營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸提供了適宜的孔徑通道,利于骨整合。p Ti的彈性模量主要由孔徑大小、孔隙率等特性決定。而將p Ti根據(jù)臨床病患需求制造成具有相應(yīng)力學(xué)特性和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的植入體,對結(jié)構(gòu)特性的高度控制,則需要電子束熔融技術(shù)的幫助。大量的體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均證實(shí)了PEMF影響骨形成,但是所采用PEMF的頻率、場強(qiáng)和刺激加載--時(shí)長等參數(shù)不同,其對骨骼細(xì)胞的作用效果不同。探究優(yōu)化的促成骨細(xì)胞活性組合參數(shù),是后續(xù)研究PEMF促骨形成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的重要前提。方法:用CAD軟件設(shè)計(jì)p Ti,直接導(dǎo)入Electron beam melting(EBM)設(shè)備,通過3D打印技術(shù),制作p Ti植入體,通過掃描電鏡(SEM)觀察,進(jìn)一步對p Ti的形貌進(jìn)行觀察與分析。根據(jù)細(xì)胞增殖活性指標(biāo),分別對PEMF單純作用于成骨細(xì)胞的脈沖刺激強(qiáng)度、加載刺激時(shí)長參數(shù)進(jìn)行較優(yōu)的篩選。結(jié)果:EBM制作出的圓柱和圓片兩種p Ti結(jié)構(gòu)特性均符合要求。頻率15 Hz的PEMF采用強(qiáng)度為20 Gs(2 m T),作用時(shí)長2 h/d的磁場組合參數(shù)促進(jìn)體外成骨細(xì)胞活性。結(jié)論:EBM是一種高效且可高度控制材料結(jié)構(gòu)特性的制造方法。所篩選出的磁場組合參數(shù)與之前課題組進(jìn)行的體內(nèi)研究結(jié)果相一致。第二部分:PEMF體外促骨形成的影響和機(jī)制研究背景:成骨細(xì)胞在骨形成過程中行使主要功能,參與骨基質(zhì)的分泌和鈣化。其對PEMF的響應(yīng),可以改善骨自身的修復(fù)能力。有眾多學(xué)者認(rèn)為PEMF對骨形成的改善取決于骨骼細(xì)胞接受刺激作用所處的階段,如增殖階段、分化階段等。但是目前仍然缺少對成骨細(xì)胞處于增殖或成熟分化等階段時(shí)接受PEMF刺激所誘發(fā)的表型進(jìn)行系統(tǒng)的研究證實(shí),缺少對處于不同細(xì)胞階段的成骨細(xì)胞接受PEMF刺激后所誘發(fā)表型的潛在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的系統(tǒng)研究。方法:通過CCK-8檢測以及細(xì)胞骨架的免疫熒光染色對PEMF刺激處于增殖期的成骨細(xì)胞的活性進(jìn)行評估,通過q RT-PCR和Western Blot對PEMF調(diào)控細(xì)胞周期的潛在經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行探究;通過堿性磷酸酶(ALP)染色、茜素紅染色、q RT-PCR和Western Blot等常用實(shí)驗(yàn)室技術(shù)手段對PEMF作用于分化階段的成骨細(xì)胞的影響以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制進(jìn)行探究。結(jié)果:在成骨細(xì)胞增殖階段,PEMF上調(diào)經(jīng)典Wnt信號通路的基因表達(dá)和蛋白分泌、表達(dá),以增強(qiáng)其下游細(xì)胞周期相關(guān)基因Ccnd1和Ccne1的表達(dá),PEMF組成骨細(xì)胞增殖能力增強(qiáng),但是ALP基因表達(dá)受到抑制;在成骨細(xì)胞分化階段,PEMF組ALP染色深染,礦化面積以及鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量增加,成骨相關(guān)基因Runx2、OCN、COL1上調(diào),經(jīng)典Wnt信號通路的基因表達(dá)和蛋白轉(zhuǎn)錄一致均為上調(diào),進(jìn)而調(diào)控其下游成骨相關(guān)的OCN、Runx2等基因表達(dá)和蛋白分泌、表達(dá)。結(jié)論:揭示出經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了PEMF對成骨細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控。第三部分:體外PEMF對p Ti上骨形成的影響及機(jī)制研究背景:p Ti具有出色的生物相容性和耐腐蝕性,加上出眾的結(jié)構(gòu)特性,使其成為理想的骨替代內(nèi)植入體。然而,PEMF對p Ti植入體骨生成和骨整合的影響一直尚未明確。因此,我們系統(tǒng)地研究了PEMF對p Ti上成骨細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。方法:采用DAPI染色觀測早期細(xì)胞黏附,通過SEM和CLSM觀察p Ti上成骨細(xì)胞形態(tài),采用CCK-8檢測細(xì)胞增殖活性,通過q RT-PCR和Wstern Blot探究經(jīng)典Wnt信號通路的表達(dá)。結(jié)果:PEMF組成骨細(xì)胞早期黏附能力增強(qiáng),p Ti表面黏附數(shù)量增多;細(xì)胞骨架發(fā)育良好,其熒光染色深染;成骨細(xì)胞微絲增多,應(yīng)力纖維增粗;電鏡結(jié)果顯示PEMF組成骨細(xì)胞表面出現(xiàn)更多的褶皺,板狀和絲狀偽足均增多。在基因表達(dá)方面,PEMF組顯著提高了成骨相關(guān)基因Runx2、Osx和COL1的表達(dá),同時(shí)增強(qiáng)了經(jīng)典Wnt信號通路的表達(dá),包括Wnt1,Lrp6和β-catenin。蛋白分泌檢測結(jié)果與基因表達(dá)相一致,充分印證了PEMF可以增強(qiáng)p Ti植入體上成骨細(xì)胞活性。結(jié)論:PEMF有利于p Ti內(nèi)部成骨細(xì)胞進(jìn)入黏附、礦化,揭示出PEMF在p Ti上調(diào)控成骨生成和新骨形成可能的主要機(jī)制為激活Wnt/β-catenin信號通路。第四部分:骨缺損動(dòng)物模型體內(nèi)PEMF對p Ti骨整合的影響和機(jī)制研究背景:p Ti的彈性模量雖然有較大改善,但是目前仍然與自然骨組織之間存在機(jī)械不匹配問題。由于p Ti的生物惰性,很容易以“機(jī)械鉚合”形式與周圍骨結(jié)合,而并非所期望的化學(xué)鍵結(jié)合方式。骨整合不理想使早期的p Ti固定得不到保證,增加了病患體內(nèi)植入體松動(dòng)的風(fēng)險(xiǎn)。因此,研發(fā)新技術(shù)加速p Ti的骨整合,提高骨修復(fù)效率和質(zhì)量,具有重要臨床意義。方法:通過外科手術(shù)方法構(gòu)建兔長骨骨缺損模型。通過Micro-CT、形態(tài)學(xué)定量分析等系統(tǒng)性評估PEMF對p Ti修復(fù)長骨骨缺損的促進(jìn)作用效果。采用q RT-PCR技術(shù)探究體內(nèi)PEMF對p Ti內(nèi)骨生成作用的潛在分子轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。結(jié)果:三維Micro-CT數(shù)據(jù)顯示PEMF刺激6周組和12周組的p Ti植入體內(nèi)部新骨長入良好,并且長入植入體內(nèi)部的新骨骨量增多;二維的冠狀面和矢狀面切片數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)了PEMF促進(jìn)更多的新骨長入p Ti內(nèi)部。定量統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示PEMF組BV/TV顯著提高,而BS/BV和Tb.Sp顯著降低,同時(shí)無論6周組還是12周組的Tb.N和Tb.Th均為高水平表達(dá)。組織形態(tài)學(xué)定量分析證實(shí)PEMF促進(jìn)更多的新小梁骨長入骨缺損區(qū)域的p Ti植入體孔徑內(nèi)。熒光雙標(biāo)分析證實(shí)在骨缺損區(qū)域PEMF組骨形成速率增加,MAR、MS/BS和BFR/BS均較對照組顯著增強(qiáng)。接受PEMF刺激的6周組和12周組均激活了經(jīng)典Wnt信號通路,包括Wnt1、Lrp6和β-catenin,成骨相關(guān)基因Runx2、BMP2和OCN的m RNA表達(dá)水平全部上調(diào)。結(jié)論:PEMF可以促進(jìn)新骨長入p Ti內(nèi)部,改善p Ti的骨整合效果,利于增強(qiáng)p Ti在體內(nèi)的長期穩(wěn)定性,經(jīng)典Wnt信號通路參與了該過程。PEMF有望成為臨床上輔助p Ti治療骨缺損的生物物理方法。
[Abstract]:Although PEMF has been widely used in clinical practice , it has been proved that PEMF can inhibit bone calcium loss and improve bone quality . In order to accelerate the integration of p - Ti , it is important to promote the early fixation of implant and increase its long - term stability in vivo . The whole study is divided into four parts : the first part : the preparation of p - Ti implant material and the parameter screening background of PEMF - promoting osteoblast activity : titanium alloy belongs to dense material , its elastic modulus is much higher than that of cancellous bone , so it is easy to lead to stress shielding of implant and its surrounding natural bone . In vitro and in vivo experiments have shown that PEMF affects bone formation . The effects of PEMF on bone formation and protein secretion and expression of PEMF on p - Ti were studied . The results showed that PEMF can promote the integration of PEMF on p - Ti internal bone defects . The results show that PEMF can promote the formation of bone formation and the formation of new bone in the bone defect region .

【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R318.08;R68

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Roel NUSSE;Wnt signaling in disease and in development[J];Cell Research;2005年01期

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本文編號：1670656