本文選題：毛囊干細胞　切入點：異種脫細胞支架　出處：《新疆醫(yī)科大學》2014年博士論文

【摘要】：目的：1.建立毛囊干細胞(Hair follicle stem cells，HFSCs)的體外培養(yǎng)方法并使用目前公認的標記物和其他手段對其進行鑒定。2.應用不同培養(yǎng)基，檢測細胞的增值情況，找出毛囊干細胞最適宜的培養(yǎng)條件。3.構建兔膀胱脫細胞基質(Bladder acellularmatrix, BAM)支架，將培養(yǎng)的毛囊干細胞種植于BAM構建細胞與支架的復合物，并在體外觀察該復合物的生物學相容性。方法：1.選用出生7-9天的清潔級SD大鼠乳鼠。經(jīng)過嚴格消毒擬切除觸須部位后，切取含毛囊的組織，在無菌環(huán)境下使用顯微外科技術分離出毛囊組織和毛囊外根鞘部。用中性蛋白酶和胰酶消化毛囊外根鞘部；利用差速貼壁法篩選貼壁快的細胞后用10%胎牛血清角質細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)的細胞可供進一步傳代或冷凍處理。培養(yǎng)出來的細胞應用倒置顯微鏡、電子顯微鏡、Giemsa染色、免疫熒光染色、流式細胞儀等鑒定，將β1整合素、 CK15、 CD34，CK7等細胞表面標志物作為鑒定依據(jù)。2.進一步用富血小板血漿對第三代毛囊干細胞進行細胞增殖實驗，以便獲取更多的優(yōu)質毛囊干細胞備用；將培養(yǎng)的干細胞懸液平分為三組，分別用DMEM/F12培養(yǎng)+體積分數(shù)10%胎牛血清、角質細胞無血清培養(yǎng)基和角質細胞無血清培養(yǎng)基+體積分數(shù)10%胎牛血清培養(yǎng)，對三組培養(yǎng)后的干細胞應用細胞活率、生長曲線、流式細胞儀鑒定標記物對三種培養(yǎng)基的培養(yǎng)效率進行比較。3.選用兔齡3-5月的新西蘭兔，空氣栓塞法處死，手術切取膀胱后顯微手術獲取粘膜下層，化學洗滌法制備膀胱脫細胞基質，其表面的結構和形態(tài)特征使用掃描電鏡觀察，掃描電競還可以同時判斷脫細胞處理后細胞的殘留與否以及脫細胞處理的效果；用Masson染色對支架材料再次鑒定；參照GB/T16886.5-2003體外細胞毒性和國家醫(yī)療器械生物學評價標準判斷其細胞毒性。最后使用毛囊干細胞生長懸液，將細胞種植到支架上，通過繪制生長曲線、掃描電鏡觀察和組織學檢查明確其生物相容性。結果：1.倒置相差顯微鏡觀察篩選后的細胞，呈現(xiàn)的形態(tài)均勻一致、折光性強、呈典型的“鋪路石狀”。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)細胞特征為核漿比例大、細胞器發(fā)育不成熟、體積小，可以認定為處于原始狀態(tài)。生長曲線顯示： P3一P6代細胞增值能力仍較強。第三代HFSCs細胞，流式細胞儀檢測干細胞標記物CK15、CD34，CK7，β1整合素等四個指標記物，其中標記物CD34與β1整合素，CK15實驗組均高于對照組，兩組間差異有統(tǒng)計學意義（p0.05），而CK7在對照組與實驗組均低表達，差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.用CCK-8比色法檢測二次離心法獲得的血小板（A組）及三次離心法獲得的血小板（B組）對細胞增殖的影響即：各組細胞的吸光度A值，進行統(tǒng)計分析后顯示在培養(yǎng)前的2天各組之間及其和對照組之間的吸光度A值差異無顯著性意義(P0.05)。第4天時A、B各富血小板血漿與對照組之間比較均有顯著統(tǒng)計學差異(P 0.05），第4、5、6天時，，應用三次離心法和應用兩次離心法制備的富血小板血漿（包括2%濃度的富血小板血漿和4%濃度富血小板血漿組）進行比較后有統(tǒng)計學意義（P0.05）。說明三次離心法制備的富血小板血漿對毛囊干細胞增殖作用效果更為的明顯。并且，也證明了在其他培養(yǎng)條件相同的情況下，高劑量富血小板血漿與低劑量富血小板血漿組比較，高劑量對促進毛囊干細胞增殖的作用更加明顯，實驗結果也顯示三次離心法制備的濃度4%組的毛囊干細胞增殖作用最為明顯。準備K-SFM+10%FBS，K-SFM，DMEN/F12+10%FBS等三種培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)。第三代的HFSCs培養(yǎng)到第6天，統(tǒng)計學方法計算細胞活率后可見DMEN+10%FBS組為（96.62±2.00）%，K-SFM+10%FBS組為（95.26±2.27）%，K-SFM組為（93.95±2.54）%，而三組細胞之間相互比較可見，細胞存活率方面三組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P0.05）。三組細胞前2d生長均較為緩慢，DMEN+10%FBS以及K-SFM+10%FBS細胞培養(yǎng)4d進入了對數(shù)生長期；而K-SFM組于5d才進入了對數(shù)生長期，K-SFM+10%FBS組7d進入平臺期，K-SFM組及DMEN+10%FBS組8d后才進入平臺期。培養(yǎng)到第三代的HFSCs第6d，取三組細胞，分別測定β1整合素（CD29）、CK15、 CD34三個細胞表面標記。所測的結果經(jīng)過比較可見： K-SFM與K-SFM+10%FBS組較DMEN+10%FBS組CD34、CK15、β1整合素（CD29）表達高，差異有統(tǒng)計學意義（P0.05），而K-SFM組與K-SFM+10%FBS組比較僅CD34表達較組高（P0.05），β1整合素（CD29）和CK15兩個細胞表面標記物K-SFM+10%FBS和K-SFM比較差異無統(tǒng)計學意義（P0.05）。3.掃描電子顯微鏡下觀察，制備的BAM為纖維網(wǎng)狀結構，網(wǎng)狀結構之中能見不規(guī)則的空隙，BAM表面未見殘留細胞。Masson染色結果顯示，膀胱各層解剖結構清晰，僅能見到均質狀態(tài)的藍色薄層膠原纖維，并且沒有看見殘留的細胞。不同濃度的BAM浸提液對細胞的毒性分級為0級或1級。將細胞支架復合物置于倒置顯微鏡下觀察，粘附于支架材料表面的細胞梭形生長，細胞排列方向一致，皿底細胞貼壁，增殖情況良好，呈“鋪路石狀”生長。復合培養(yǎng)第5天，材料周圍的皿底細胞匯合達到80%以上，材料表面的細胞數(shù)量也明顯的增加。細胞-支架復合培養(yǎng)之中，對照組與實驗組細胞經(jīng)過測定，生長曲線增殖一致，均于培養(yǎng)到7-8天進入平臺期。進一步表明，細胞于材料的表面生長狀況良好，毛囊干細胞和BAM材料具有良好的生物相容性。結論：1.通過聯(lián)合應用顯微分離技術、兩步酶法以及差速貼壁法，能夠獲得純度較高，增殖能力強的毛囊干細胞。聯(lián)合使用CD34、β1整合素，CK15等細胞標記物可以進行毛囊干細胞的鑒定。毛囊干細胞具有向脂肪細胞、骨細胞分化能力，可作為組織工程中的種子細胞。2.富血小板血漿對毛囊干細胞的增長有促進作用，三次離心法濃度為4%組富血小板血漿對細胞增殖效果最明顯。K-SFM+10%FBS培養(yǎng)基較DMEM/F12培養(yǎng)基對于毛囊干細胞的生長有更好的促進作用，并且加入血清后可以增強干細胞增殖能力，而對細胞純度基本沒有影響。3.膀胱脫細胞支架的細胞毒性很低，與培養(yǎng)的大鼠HFSCs的生物相容性良好，可作為構建膀胱的生物支架材料。體外培養(yǎng)7-8天后細胞在皿表面以及脫細胞支架上的生長進入了平臺期，此時是將毛囊干細胞-膀胱脫細胞基質支架復合物移植到大鼠體內的最佳時機。本研究對毛囊干細胞體外培養(yǎng)、構建BAM、以及細胞-BAM復合物進行了探索，為我們將HFSCs-BAM復合物植入體內以及將組織工程膀胱應用于臨床，提供了重要的實驗依據(jù)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：新疆醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R318

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本文編號：1657389