本文選題：毛囊干細(xì)胞　切入點(diǎn)：異種脫細(xì)胞支架　出處：《新疆醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：目的：1.建立毛囊干細(xì)胞(Hair follicle stem cells，HFSCs)的體外培養(yǎng)方法并使用目前公認(rèn)的標(biāo)記物和其他手段對(duì)其進(jìn)行鑒定。2.應(yīng)用不同培養(yǎng)基，檢測(cè)細(xì)胞的增值情況，找出毛囊干細(xì)胞最適宜的培養(yǎng)條件。3.構(gòu)建兔膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)(Bladder acellularmatrix, BAM)支架，將培養(yǎng)的毛囊干細(xì)胞種植于BAM構(gòu)建細(xì)胞與支架的復(fù)合物，并在體外觀察該復(fù)合物的生物學(xué)相容性。方法：1.選用出生7-9天的清潔級(jí)SD大鼠乳鼠。經(jīng)過(guò)嚴(yán)格消毒擬切除觸須部位后，切取含毛囊的組織，在無(wú)菌環(huán)境下使用顯微外科技術(shù)分離出毛囊組織和毛囊外根鞘部。用中性蛋白酶和胰酶消化毛囊外根鞘部；利用差速貼壁法篩選貼壁快的細(xì)胞后用10%胎牛血清角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)的細(xì)胞可供進(jìn)一步傳代或冷凍處理。培養(yǎng)出來(lái)的細(xì)胞應(yīng)用倒置顯微鏡、電子顯微鏡、Giemsa染色、免疫熒光染色、流式細(xì)胞儀等鑒定，將β1整合素、 CK15、 CD34，CK7等細(xì)胞表面標(biāo)志物作為鑒定依據(jù)。2.進(jìn)一步用富血小板血漿對(duì)第三代毛囊干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，以便獲取更多的優(yōu)質(zhì)毛囊干細(xì)胞備用；將培養(yǎng)的干細(xì)胞懸液平分為三組，分別用DMEM/F12培養(yǎng)+體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基和角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基+體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清培養(yǎng)，對(duì)三組培養(yǎng)后的干細(xì)胞應(yīng)用細(xì)胞活率、生長(zhǎng)曲線、流式細(xì)胞儀鑒定標(biāo)記物對(duì)三種培養(yǎng)基的培養(yǎng)效率進(jìn)行比較。3.選用兔齡3-5月的新西蘭兔，空氣栓塞法處死，手術(shù)切取膀胱后顯微手術(shù)獲取粘膜下層，化學(xué)洗滌法制備膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)，其表面的結(jié)構(gòu)和形態(tài)特征使用掃描電鏡觀察，掃描電競(jìng)還可以同時(shí)判斷脫細(xì)胞處理后細(xì)胞的殘留與否以及脫細(xì)胞處理的效果；用Masson染色對(duì)支架材料再次鑒定；參照GB/T16886.5-2003體外細(xì)胞毒性和國(guó)家醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)判斷其細(xì)胞毒性。最后使用毛囊干細(xì)胞生長(zhǎng)懸液，將細(xì)胞種植到支架上，通過(guò)繪制生長(zhǎng)曲線、掃描電鏡觀察和組織學(xué)檢查明確其生物相容性。結(jié)果：1.倒置相差顯微鏡觀察篩選后的細(xì)胞，呈現(xiàn)的形態(tài)均勻一致、折光性強(qiáng)、呈典型的“鋪路石狀”。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞特征為核漿比例大、細(xì)胞器發(fā)育不成熟、體積小，可以認(rèn)定為處于原始狀態(tài)。生長(zhǎng)曲線顯示： P3一P6代細(xì)胞增值能力仍較強(qiáng)。第三代HFSCs細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)記物CK15、CD34，CK7，β1整合素等四個(gè)指標(biāo)記物，其中標(biāo)記物CD34與β1整合素，CK15實(shí)驗(yàn)組均高于對(duì)照組，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p0.05），而CK7在對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組均低表達(dá)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.用CCK-8比色法檢測(cè)二次離心法獲得的血小板（A組）及三次離心法獲得的血小板（B組）對(duì)細(xì)胞增殖的影響即：各組細(xì)胞的吸光度A值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后顯示在培養(yǎng)前的2天各組之間及其和對(duì)照組之間的吸光度A值差異無(wú)顯著性意義(P0.05)。第4天時(shí)A、B各富血小板血漿與對(duì)照組之間比較均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P 0.05），第4、5、6天時(shí)，，應(yīng)用三次離心法和應(yīng)用兩次離心法制備的富血小板血漿（包括2%濃度的富血小板血漿和4%濃度富血小板血漿組）進(jìn)行比較后有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。說(shuō)明三次離心法制備的富血小板血漿對(duì)毛囊干細(xì)胞增殖作用效果更為的明顯。并且，也證明了在其他培養(yǎng)條件相同的情況下，高劑量富血小板血漿與低劑量富血小板血漿組比較，高劑量對(duì)促進(jìn)毛囊干細(xì)胞增殖的作用更加明顯，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示三次離心法制備的濃度4%組的毛囊干細(xì)胞增殖作用最為明顯。準(zhǔn)備K-SFM+10%FBS，K-SFM，DMEN/F12+10%FBS等三種培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)。第三代的HFSCs培養(yǎng)到第6天，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算細(xì)胞活率后可見(jiàn)DMEN+10%FBS組為（96.62±2.00）%，K-SFM+10%FBS組為（95.26±2.27）%，K-SFM組為（93.95±2.54）%，而三組細(xì)胞之間相互比較可見(jiàn)，細(xì)胞存活率方面三組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。三組細(xì)胞前2d生長(zhǎng)均較為緩慢，DMEN+10%FBS以及K-SFM+10%FBS細(xì)胞培養(yǎng)4d進(jìn)入了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；而K-SFM組于5d才進(jìn)入了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，K-SFM+10%FBS組7d進(jìn)入平臺(tái)期，K-SFM組及DMEN+10%FBS組8d后才進(jìn)入平臺(tái)期。培養(yǎng)到第三代的HFSCs第6d，取三組細(xì)胞，分別測(cè)定β1整合素（CD29）、CK15、 CD34三個(gè)細(xì)胞表面標(biāo)記。所測(cè)的結(jié)果經(jīng)過(guò)比較可見(jiàn)： K-SFM與K-SFM+10%FBS組較DMEN+10%FBS組CD34、CK15、β1整合素（CD29）表達(dá)高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），而K-SFM組與K-SFM+10%FBS組比較僅CD34表達(dá)較組高（P0.05），β1整合素（CD29）和CK15兩個(gè)細(xì)胞表面標(biāo)記物K-SFM+10%FBS和K-SFM比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。3.掃描電子顯微鏡下觀察，制備的BAM為纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)之中能見(jiàn)不規(guī)則的空隙，BAM表面未見(jiàn)殘留細(xì)胞。Masson染色結(jié)果顯示，膀胱各層解剖結(jié)構(gòu)清晰，僅能見(jiàn)到均質(zhì)狀態(tài)的藍(lán)色薄層膠原纖維，并且沒(méi)有看見(jiàn)殘留的細(xì)胞。不同濃度的BAM浸提液對(duì)細(xì)胞的毒性分級(jí)為0級(jí)或1級(jí)。將細(xì)胞支架復(fù)合物置于倒置顯微鏡下觀察，粘附于支架材料表面的細(xì)胞梭形生長(zhǎng)，細(xì)胞排列方向一致，皿底細(xì)胞貼壁，增殖情況良好，呈“鋪路石狀”生長(zhǎng)。復(fù)合培養(yǎng)第5天，材料周圍的皿底細(xì)胞匯合達(dá)到80%以上，材料表面的細(xì)胞數(shù)量也明顯的增加。細(xì)胞-支架復(fù)合培養(yǎng)之中，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞經(jīng)過(guò)測(cè)定，生長(zhǎng)曲線增殖一致，均于培養(yǎng)到7-8天進(jìn)入平臺(tái)期。進(jìn)一步表明，細(xì)胞于材料的表面生長(zhǎng)狀況良好，毛囊干細(xì)胞和BAM材料具有良好的生物相容性。結(jié)論：1.通過(guò)聯(lián)合應(yīng)用顯微分離技術(shù)、兩步酶法以及差速貼壁法，能夠獲得純度較高，增殖能力強(qiáng)的毛囊干細(xì)胞。聯(lián)合使用CD34、β1整合素，CK15等細(xì)胞標(biāo)記物可以進(jìn)行毛囊干細(xì)胞的鑒定。毛囊干細(xì)胞具有向脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞分化能力，可作為組織工程中的種子細(xì)胞。2.富血小板血漿對(duì)毛囊干細(xì)胞的增長(zhǎng)有促進(jìn)作用，三次離心法濃度為4%組富血小板血漿對(duì)細(xì)胞增殖效果最明顯。K-SFM+10%FBS培養(yǎng)基較DMEM/F12培養(yǎng)基對(duì)于毛囊干細(xì)胞的生長(zhǎng)有更好的促進(jìn)作用，并且加入血清后可以增強(qiáng)干細(xì)胞增殖能力，而對(duì)細(xì)胞純度基本沒(méi)有影響。3.膀胱脫細(xì)胞支架的細(xì)胞毒性很低，與培養(yǎng)的大鼠HFSCs的生物相容性良好，可作為構(gòu)建膀胱的生物支架材料。體外培養(yǎng)7-8天后細(xì)胞在皿表面以及脫細(xì)胞支架上的生長(zhǎng)進(jìn)入了平臺(tái)期，此時(shí)是將毛囊干細(xì)胞-膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)支架復(fù)合物移植到大鼠體內(nèi)的最佳時(shí)機(jī)。本研究對(duì)毛囊干細(xì)胞體外培養(yǎng)、構(gòu)建BAM、以及細(xì)胞-BAM復(fù)合物進(jìn)行了探索，為我們將HFSCs-BAM復(fù)合物植入體內(nèi)以及將組織工程膀胱應(yīng)用于臨床，提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：新疆醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R318

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9 朱培成;yす

本文編號(hào)：1657389