本文選題：生物人工肝　切入點：生物材料　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景和目的我國是一個“肝病大國”,各種肝病引起的急性肝功能衰竭是一種嚴(yán)重的臨床綜合征,其致死率高達(dá)60%-90%[1]。生物人工肝(bioartificialliver,BAL)作為肝功能衰竭病人的有效治療措施及肝移植前的替代手段,受到廣泛關(guān)注而成為當(dāng)前研究熱點[2-5]。BAL是以人工培養(yǎng)的肝細(xì)胞為基礎(chǔ)構(gòu)建的體外反應(yīng)裝置,其生物學(xué)支持作用主要來源于肝細(xì)胞的合成、代謝和解毒等功能,因此生物材料即肝細(xì)胞源是BAL的核心部分[6]。理想的BAL生物材料應(yīng)具備:(1)人源性;(2)表型正常;(3)易于獲得;(4)易于培養(yǎng)且能迅速生長至高密度;(5)具有良好的分化狀態(tài)及成熟肝細(xì)胞的全部生物代謝功能[7]。但是現(xiàn)在尚無任何一種細(xì)胞材料能滿足以上所有條件。目前常用的生物材料及缺陷主要有:(1)新鮮分離的成人原代肝細(xì)胞,具備肝細(xì)胞的所有功能,無疑是BAL最理想的生物材料,但由于來源嚴(yán)重缺乏,體外難以增殖,而無法實現(xiàn)臨床普及應(yīng)用。(2)異種肝細(xì)胞,主要應(yīng)用的是豬肝細(xì)胞,有多種進(jìn)入臨床試驗階段的BAL都采用它作為生物材料,但由于可能引起異種蛋白反應(yīng)和動物源性傳染病,許多歐洲國家已明確禁止豬肝細(xì)胞用于BAL。(3)人源性肝細(xì)胞株,包括兩種,一是腫瘤來源的肝細(xì)胞株,它們來源廣泛,具有正常肝細(xì)胞的某些功能,培養(yǎng)后能迅速達(dá)到人工肝治療的數(shù)量需求[8],但其潛在的致瘤危險性難以完全排除;二是基因工程技術(shù)獲得的永生化肝細(xì)胞,主要通過病毒載體將SV40LT或hTERT等永生化基因?qū)敫渭?xì)胞而構(gòu)建,但是SV40LT也存在潛在的致瘤性,病毒載體還可能導(dǎo)致不可預(yù)知的細(xì)胞遺傳障礙[9]。(4)其他,如肝干細(xì)胞,由于其分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化技術(shù)尚未成熟,要進(jìn)入應(yīng)用研究階段時日尚早。由于缺乏理想的生物材料,BAL技術(shù)現(xiàn)尚難成為可靠、有力的治療手段,但是研究者仍然相信隨著研究的不斷深入,BAL最終將會為急性肝衰竭的治療帶來革命性的變化。本研究論文在既往研究的基礎(chǔ)上,著重對如何提高人源性肝細(xì)胞株的安全性問題,提出了自己的觀點,并作出了初步的探索。首先針對腫瘤來源的肝細(xì)胞株,提出了利用高分化肝癌組織或良性病變肝臟組織構(gòu)建新型人源性肝細(xì)胞株;其次,針對基因工程獲取的永生化肝細(xì)胞株,提出了基于piggyBac的新型肝細(xì)胞永生化載體系統(tǒng);最后,我們還對硝酸纖維素(NC)膜做為BAL肝細(xì)胞源生長的支持材料的可能性進(jìn)行了初步研究�？傊�,最終為解決理想生物材料缺乏這一制約BAL發(fā)展的問題作出努力。方法1、不同人肝細(xì)胞株肝臟功能水平的比較研究。收集南方醫(yī)院手術(shù)切除肝臟標(biāo)本病變周圍的非腫瘤組織,采用本課題組申請有專利技術(shù)的肝細(xì)胞分離器械盒(專利號:201120133192.5)進(jìn)行原代成人肝細(xì)胞的分離,含15%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基常規(guī)條件下培養(yǎng)。提取12種人肝細(xì)胞株及原代成人肝細(xì)胞的RNA后,采用實時定量PCR技術(shù)檢測12種肝臟功能相關(guān)基因mRNA的表達(dá)。上述細(xì)胞爬片后,通過細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測細(xì)胞功能相關(guān)蛋白ALB、CYP 2E1的表達(dá),同時收集細(xì)胞培養(yǎng)上清采用全自動生化分析儀測定上清中白蛋白及尿素氮的含量。2、不同分化程度肝臟腫瘤組織的肝臟功能水平的比較。收集2009年1月-2011年12月期間在南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院肝膽外科行外科手術(shù)切除的34例患者的肝臟組織標(biāo)本,包括高分化肝癌組織12例、低分化肝癌組織12例、病變周圍相對正常肝組織12例(有2例與上述肝癌組織取自同一患者)。提取組織RNA后,采用實時定量PCR技術(shù)檢測上述三類組織肝臟功能相關(guān)基因mRNA的表達(dá)。同時采用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測細(xì)胞功能相關(guān)蛋白ALB、CYP2E1的表達(dá)。3、新型人源性人工肝用肝細(xì)胞株的構(gòu)建。細(xì)胞分離程序參照上述原代成人肝細(xì)胞的分離,培養(yǎng)基采用含20%胎牛血清的DMEM,0.25%胰酶消化傳代。采用上述實時定量PCR技術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)及上清檢測評價肝臟功能相關(guān)指標(biāo)表達(dá)情況,并與原代成人肝細(xì)胞及C3A細(xì)胞相比較。4、無病毒可回復(fù)性肝細(xì)胞永生化載體的構(gòu)建及應(yīng)用。重疊延伸PCR技術(shù)擴(kuò)增 attB1-Kozak-hTERT (前端)-attB2 和 attB1-hTERT (后端)/E2A/eGFP/F2A/neo-attB2,對相應(yīng)大小條帶切膠回收后,通過Gateway重組克隆技術(shù)BR反應(yīng)和LR反應(yīng),以及酶切連接,構(gòu)建最終目的載體PB-hTERT/E2A/eGFP/F2A/neo。隨后將永生化載體PB-hTERT/E2A/eGFP/F2A/neo和載體pCAGG-PBase共轉(zhuǎn)染HL-7702細(xì)胞后,檢測其hTERT基因的表達(dá)情況。5、NC膜作為BAL細(xì)胞生長支架材料的研究。將BAL用細(xì)胞材料接種于NC膜上,通過掃描電鏡技術(shù)及HE染色技術(shù)觀察其生長情況,流式細(xì)胞術(shù)及LDH測定評價細(xì)胞凋亡情況,免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)等觀察部分肝臟功能蛋白的表達(dá)情況。同時以蓋玻片或培養(yǎng)板等普通培養(yǎng)介質(zhì)作為對照。6、統(tǒng)計分析。統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS13.0軟件,對于mRNA的表達(dá)水平的組間差異,方差齊性檢驗后行多個獨立樣本的非參數(shù)檢驗;對于計數(shù)資料采用行列表資料的X2檢驗;對于LDH漏出檢測分析,組間差異采用兩因素的方差分析;對于凋亡檢測分析,組間差異采用兩樣本的t檢驗,P 0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1、不同人肝細(xì)胞株肝臟功能水平的比較研究。實時定量PCR檢測結(jié)果顯示現(xiàn)有12種人肝細(xì)胞株12個肝臟功能相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于原代成人肝細(xì)胞的表達(dá)水平,且不同肝細(xì)胞株之間差異較大,其中HepG2、C3A和Hep 3B2.1-7肝細(xì)胞特異性功能相對較好,尤其是合成功能,細(xì)胞免疫熒光證實了部分相關(guān)基因的蛋白水平表達(dá),培養(yǎng)上清中白蛋白和尿素氮的含量與實時定量PCR檢測結(jié)果基本相符。2、不同分化程度肝臟腫瘤組織的肝臟功能水平的比較。實時定量PCR檢測結(jié)果顯示肝臟合成、代謝和解毒相關(guān)的12個基因的mRNA表達(dá)水平除GST-π外,高分化肝癌組織、低分化肝癌組織和癌旁組織之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(X2≥16.635, P0. 001),而且癌旁組織高于高分化肝癌組織高于低分化肝癌組織。免疫組化檢測肝細(xì)胞特異性功能相關(guān)蛋白ALB、CYP2E1的表達(dá)情況與實時定量PCR檢測結(jié)果基本相符。3、新型人源性人工肝用肝細(xì)胞株的構(gòu)建。利用高分化肝癌和良性病變肝臟組織分別構(gòu)建兩株BAL用肝細(xì)胞材料,分別命名為NHBL1和NHBL2。NHBL1細(xì)胞經(jīng)實時定量PCR檢測顯示在12個肝臟功能相關(guān)基因中,GST-π的mRNA表達(dá)水平比C3A細(xì)胞略高,但其他指標(biāo)均不同程度的低于C3A細(xì)胞,其中相差在1倍之內(nèi)的有AAT、TF、G6P,2倍之內(nèi)的有ALB、TTR、CYP 3A4,5倍之內(nèi)的有CPS-1,CYP 3A,其他指標(biāo)差距均超過5倍。培養(yǎng)上清中單細(xì)胞ALB生成量分別為 2.200×10-5g/L,0.277×10-5g/L,0.496×10-5g/L,BUN 生成量分別為 1.965×10-5mmol/L 0.109×10-5mmol/L, 0.237×10-5mmol/L。NHBL2 細(xì)胞來源為36歲男性肝癌患者的癌旁肝組織,已傳25代。通過實時熒光定量PCR分析,我們發(fā)現(xiàn)ALB,ATT, TF,TTR,TAT和CYP3A4的水平比C3A細(xì)胞略低,其他六個指標(biāo)均高于C3A細(xì)胞。4、無病毒可回復(fù)性肝細(xì)胞永生化載體的構(gòu)建及應(yīng)用。PCR及酶切和測序鑒定均證實成功構(gòu)建了肝細(xì)胞永生化載體PB-hTERT/E2A/eGFP/F2A/neo,目的基因序列與GenBank報道一致,并將其與載體pCAGG-PBase成功轉(zhuǎn)染至HL-7702 細(xì)胞。5、NC膜作為BAL細(xì)胞生長支架材料的研究。掃描電子顯微鏡下NC膜的形態(tài):低倍鏡下NC膜表面較為平整光滑,高倍鏡下NC膜呈現(xiàn)海綿樣空間立體結(jié)構(gòu),膜孔徑精確度高,具有均一的孔徑。HE染色并透明處理后鏡下觀察細(xì)胞在NC膜和玻片上呈現(xiàn)高貼壁狀態(tài),細(xì)胞逐漸增殖,細(xì)胞形態(tài)一致,掃描電鏡下也呈現(xiàn)出類似的表現(xiàn)。生長在NC膜上細(xì)胞的凋亡情況與普通介質(zhì)之上的無明顯差異(F=0.267, P=0.609)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示功能相關(guān)蛋白仍正常表達(dá)。結(jié)論1、研究中認(rèn)為現(xiàn)有各種人源性肝細(xì)胞株與理想BAL生物材料的差距仍較大,主要是高度惡性腫瘤組織來源,安全性顧慮較大,而且功能上還遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法達(dá)到正常成人肝細(xì)胞的水平。2、研究中篩選出兩株高分化肝癌和良性病變肝臟組織來源的細(xì)胞株,功能水平接近于C3A細(xì)胞,但一定程度上降低了應(yīng)用的安全性顧慮,同時也為構(gòu)建新型人工肝細(xì)胞材料提供了一種新的思路。3、研究中建立了一種基于piggyBac轉(zhuǎn)座酶的新型肝細(xì)胞永生化載體系統(tǒng),與傳統(tǒng)永生化技術(shù)相比主要優(yōu)勢在于無病毒載體的參與,因而更適于下一步的臨床應(yīng)用。4、研究中初步論證了 NC膜對BAL用細(xì)胞材料生長的支持作用,為新型人工肝支持系統(tǒng)生物反應(yīng)器的構(gòu)建提供了實驗依據(jù)。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R318.1;R575.3

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 張飛媛;唐南洪;;基于生物人工肝細(xì)胞材料研究新進(jìn)展[J];福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2011年04期

2 李蘭娟;;生物人工肝的臨床應(yīng)用進(jìn)展[J];中國實用外科雜志;2005年12期

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本文編號：1618550