本文選題：誘導(dǎo)多能干細(xì)胞　切入點(diǎn)：重編程　出處：《華東師范大學(xué)》2013年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：誘導(dǎo)干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell,iPS或iPSCs)的建立在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著極大的應(yīng)用潛力。但是,在該技術(shù)應(yīng)用于臨床之前,安全與效率是其必須應(yīng)對的重要問題。 眾多研究致力于推進(jìn)以上問題的解決：介導(dǎo)重編程因子轉(zhuǎn)染供體細(xì)胞的方法由最初的整合型病毒(逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒)到非整合型病毒(腺病毒),繼而發(fā)展到無病毒(如PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)、episome),直至穿膜肽介導(dǎo)的目的因子融合蛋白直接轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)。09年4月,Zhou等人利用11精氨酸穿膜肽介導(dǎo)四因子融合蛋白建立了小鼠蛋白iPS細(xì)胞系(protin-iPS, p-iPS),同年5月Kim等人利用同方法建立了人p-iPS。由于蛋白誘導(dǎo)iPS徹底排除了外源遺傳物質(zhì),被認(rèn)為是目前為止最安全的iPS誘導(dǎo)方法。但是,以上的非整合型的誘導(dǎo)方法效率低、耗時長、不穩(wěn)定,增加了細(xì)胞變異的可能,限制了iPS在臨床和研究方面的應(yīng)用。 TAT-PTD是迄今為止應(yīng)用最為廣泛的轉(zhuǎn)膜肽,大量研究表明該系統(tǒng)能夠介導(dǎo)多種融合蛋白高效轉(zhuǎn)染不同種類的細(xì)胞且重折疊后的外源蛋白多具有生物學(xué)活性。我們嘗試檢測TAT-PTD轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是否可以促進(jìn)蛋白iPS細(xì)胞系的建立。在本工作中,我們運(yùn)用TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域構(gòu)建了TAT-PTD介導(dǎo)的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。通過原核表達(dá)His-TAT-Sox2/Oct4/Klf4/c-Myc/Nanog等多能因子融合蛋白；從TAT融合蛋白轉(zhuǎn)染條件、工作濃度、孵育時間等方面優(yōu)化轉(zhuǎn)染效果,并檢測融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性；在多細(xì)胞系上測試TAT-目的蛋白的轉(zhuǎn)染效果以測定所得優(yōu)化條件的穩(wěn)定性和通用性。在所得條件下,于成體細(xì)胞重編程系統(tǒng)中比較TAT和11精氨酸(11R)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的異同,并探索基于蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的重編程因子(reprogramming factor, RF)重組蛋白誘導(dǎo)iPS的條件。我們發(fā)現(xiàn)：TAT和11R融合重編程因子具有轉(zhuǎn)錄活性,在熒光素報(bào)告系統(tǒng)中能夠激活其對應(yīng)的下游靶基因的報(bào)告基因。TAT-RFs在轉(zhuǎn)錄活性上要優(yōu)于相應(yīng)的11R-RFs,但弱于相應(yīng)的病毒因子。在我們構(gòu)建的“3病毒+1蛋白”重編程系統(tǒng)中,TAT-RF能夠一定程度上替代相應(yīng)病毒因子的作用,同時利用該實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)最終確定各TAT-轉(zhuǎn)錄因子在重編程過程中的工作條件,確定了TAT-轉(zhuǎn)錄因子融合蛋白(4因子)誘導(dǎo)iPS的誘導(dǎo)策略和具體條件：四個TAT-RFs因子(各50nM工作濃度,每次孵育2h)每48h孵育HFFs細(xì)胞至第17天。遺憾的是,在以上實(shí)驗(yàn)條件下,我們并沒有獲得iPS狀克隆(OCT4, NANOG和AP陽性)。這個結(jié)果暗示TAT-RFs的轉(zhuǎn)錄活性或許相較對應(yīng)病毒因子較弱。我們又進(jìn)行了進(jìn)一步的探索：增加TAT-mNanog和聯(lián)合使用小分子組蛋白去乙�；敢种苿￢PA來增強(qiáng)重組蛋白的重編程活性。在此方法下,兩周即可出現(xiàn)與iPS形態(tài)相似的克隆。經(jīng)檢測,這些克隆具iPS形態(tài)學(xué)特征,呈AP染色陽性,在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平上表達(dá)多能相關(guān)基因。這說明TAT介導(dǎo)的融合蛋白轉(zhuǎn)錄因子在較短時間內(nèi)起始了人成體細(xì)胞HFFs的重編程過程,且AP陽性克隆得率與病毒誘導(dǎo)iPS的效率相當(dāng)。 我們的工作的興趣點(diǎn)在于：利用不同系統(tǒng)中(如從熒光素報(bào)告系統(tǒng),“3病毒+1蛋白”重編程系統(tǒng))摸索PTD-融合蛋白轉(zhuǎn)染條件、工作濃度、孵育時間等方面的合適條件,探索優(yōu)化蛋白iPS誘導(dǎo)策略。針對蛋白轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄活性可能低于相應(yīng)病毒轉(zhuǎn)錄因子這一制約蛋白-iPS應(yīng)用的瓶頸,我們增加TAT-mNanog和聯(lián)合使用小分子組蛋白去乙�；敢种苿￢PA來增強(qiáng)重組蛋白的重編程活性,從而在細(xì)胞水平上(AP染色,多能因子在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá))證明說明TAT介導(dǎo)的融合蛋白轉(zhuǎn)錄因子在較短時間內(nèi)起始了人成體細(xì)胞HFFs的重編程過程,且AP陽性克隆得率與病毒誘導(dǎo)iPS的效率相當(dāng)。 我們的工作對TAT融合重編程因子在重編程過程中的系統(tǒng)檢測,可以為建立具臨床應(yīng)用價(jià)值和不含外源遺傳物質(zhì)的人iPSC的獲得提供依據(jù)。
[Abstract]:The establishment of induced pluripotent stem cell (iPS or iPSCs) has great potential in the field of regenerative medicine. However, before the technology is applied to clinic, safety and efficiency are important issues that it must deal with.
To solve many studies dedicated to advancing the above problems: mediated method of reprogramming factor transfected donor cells is integrated by virus first (retroviral, lentiviral) to the non integrated virus (adenovirus), and then to no virus (such as PB transposon system, episome), until the transmembrane peptide mediated the objective factor fusion protein is directly transported to the cell.09 in April, Zhou et al use 11 arginine peptide mediated four factor fusion protein was established iPS cell mouse protein (protin-iPS, p-iPS) system, Kim et al in May of the same year is established by using p-iPS. as the protein iPS induced by eliminating the exogenous genetic material with method is considered to be by far the most secure iPS induced method. However, the non integrated induction method above the low efficiency, time-consuming, instability, increased cell variation may limit the application of iPS in clinical and research.
TAT-PTD is by far the most widely used transmembrane peptides, a large number of studies show that the system can mediate a variety of exogenous protein fusion cell transfection efficiency of different types and protein after refolding of biologically active. We try to establish whether the system can promote the detection of TAT-PTD transduction protein iPS cell line. In this work, we the use of TAT protein transduction domain constructs protein delivery system mediated by TAT-PTD. The prokaryotic expression of His-TAT-Sox2/Oct4/Klf4/c-Myc/Nanog multi factor fusion protein fusion protein; transfection conditions, from the concentration of TAT, optimization of transfection effect of incubation time, stability and detection of fusion protein in cells; to determine the stability of the optimal conditions and the general test TAT- protein transfection effect in multicellular system. In the condition, in a somatic cell reprogramming system In comparison with TAT and 11 arginine (11R) and the protein transduction domain, and to explore the reprogramming factors based on protein transduction domain (reprogramming factor RF) iPS recombinant protein induced conditions. We found that TAT and 11R fusion of reprogramming factors with transcription activity, reporter gene.TAT-RFs can activate downstream target genes the corresponding report in fluorescein in the system is superior to the corresponding 11R-RFs in transcriptional activity, but weaker than the corresponding viral factors. In our construction of the "3 virus +1 protein" TAT-RF programming system, to a certain extent for the generation of the corresponding virus factors, at the same time using the experimental system to determine the final TAT- transcription factor working conditions in the reprogramming process, determine the TAT- transcription factor fusion protein (factor 4) induction strategy and specific conditions induced by iPS: four TAT-RFs factors (each 50nM work each concentration. 2H incubation of HFFs cells incubated with 48h) each to seventeenth days. Unfortunately, in the above experimental conditions, we did not get a iPS like clone (OCT4, NANOG and AP positive). The results suggest that the transcriptional activity of TAT-RFs may be compared with corresponding virus factor is weak. We have made further exploration: the increase of TAT-mNanog and the combined use of small molecule inhibitors of histone deacetylase VPA to enhance recombinant protein reprogramming activity. In this way, two weeks can appear similar to the iPS clone form. After testing, these clones with iPS morphology, AP staining was positive, multiple related gene expression at the transcriptional level and protein level this shows that the reprogramming process. Transcription factor TAT mediated fusion in a relatively short period of time starting the adult human HFFs cells, and the efficiency of AP positive clones yield and virus induced iPS.
Our work points of interest lies in using different systems (such as fluorescein from reporting system, "3 virus +1 protein reprogramming system) explore PTD- fusion protein transfection conditions, concentration, incubation time and suitable conditions, explore the optimal strategy for protein protein iPS induced transcriptional activity may be lower than the bottleneck the corresponding virus transcription factor that restricts the application of the -iPS protein, we added TAT-mNanog and combined use of small molecule inhibitors of histone deacetylase VPA to enhance recombinant protein reprogramming activity, resulting in cell level (AP staining, multi factor expression at the transcriptional level and protein level) that reprogramming process transcription factor TAT mediated fusion in a relatively short period of time starting the adult human HFFs cells, and the efficiency of AP positive clones yield and virus induced iPS.
Our work on systematic detection of TAT fusion reprogramming factor in reprogramming process can provide a basis for establishing clinical application value and human iPSC without exogenous genetic material.

【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R318.0

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本文編號：1615797