本文選題：脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞　切入點(diǎn)：縮宮素　出處：《吉林大學(xué)》2014年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：SiO2有序介孔材料作為藥物載體使用已經(jīng)有十余年時(shí)間。這種生物陶瓷類(lèi)材料比之傳統(tǒng)的藥物載體系統(tǒng)更加受到青睞主要是源于兩大特性：高度可控的物理化學(xué)性能和在材料刺激-應(yīng)答方面的潛能。有序介孔材料本身具有通過(guò)共價(jià)鍵與特定生物活性分子相嫁接，從而刺激靶細(xì)胞形成新生組織的優(yōu)良特性，就更加復(fù)合組織工程學(xué)材料的需求，尤其是骨組織工程材料。本實(shí)驗(yàn)用模板法將材料制備成具有納米級(jí)介孔結(jié)構(gòu)的藥物載體，并對(duì)材料進(jìn)行表征和體內(nèi)、外生物活性檢測(cè)。 OT是自垂體后葉分離出的一種9肽激素，在體外可通過(guò)芐氧羰醛亮氨酸對(duì)硝基苯酯經(jīng)化學(xué)合成法制得。OT在體內(nèi)的功能性受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族中的速激肽受體。隨著縮宮素在骨代謝領(lǐng)域相關(guān)作用的逐步闡明，已經(jīng)有學(xué)者預(yù)言未來(lái)它將成為能夠治療骨質(zhì)疏松的藥物之一。 本實(shí)驗(yàn)選擇OT作為研究對(duì)象，一方面檢測(cè)OT在刺激脂肪源干細(xì)胞增殖和成骨向分化方面的作用；同時(shí)將其作為藥物模型進(jìn)行了OT—SBA-15載藥體系的裝載、釋放動(dòng)力學(xué)檢測(cè)以及載藥體系的體內(nèi)、外安全性實(shí)驗(yàn)。為今后進(jìn)一步開(kāi)展動(dòng)物模型研究奠定基礎(chǔ)。 1人脂肪干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 目的：分離、培養(yǎng)和鑒定人脂肪干細(xì)胞 方法：通過(guò)合法途徑獲取健康人廢棄脂肪組織，處理后接種于10%胎牛血清、100U/ml雙抗的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，常規(guī)培養(yǎng)，定時(shí)換液，待細(xì)胞融合達(dá)80%，胰酶消化傳代。取傳三代生長(zhǎng)穩(wěn)定細(xì)胞鏡下觀察形態(tài)。取傳3~4代生長(zhǎng)穩(wěn)定的細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物CD44、CD29、CD34和CD45；用成骨培養(yǎng)基誘導(dǎo)并茜素紅染色評(píng)價(jià)其成骨向分化潛能；用成脂肪培養(yǎng)基誘導(dǎo)并紅油O染色評(píng)價(jià)其成脂向分化潛能。 結(jié)果：傳三代后細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定，呈長(zhǎng)梭型，形態(tài)與成纖維細(xì)胞類(lèi)似。核仁清晰、邊界明顯、細(xì)胞生長(zhǎng)密集是呈魚(yú)群狀或旋渦狀生長(zhǎng)。細(xì)胞表面標(biāo)記物鑒定間充質(zhì)細(xì)胞表面特征性標(biāo)記物CD44、CD29呈高表達(dá)；造血干細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞表面特征性標(biāo)記物CD34和白細(xì)胞表面特征性標(biāo)記物CD45均為陰性，說(shuō)明細(xì)胞為高度均一性的脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞。經(jīng)成骨誘導(dǎo)劑培養(yǎng)后茜素紅染色可見(jiàn)明顯的鈣化結(jié)節(jié)，說(shuō)明細(xì)胞具有成骨向分化潛能。經(jīng)成脂誘導(dǎo)劑培養(yǎng)后紅油O染色可見(jiàn)明顯的脂滴，說(shuō)明細(xì)胞具有成脂向分化潛能。 2縮宮素對(duì)人脂肪源干細(xì)胞成骨活性的影響 目的：評(píng)價(jià)縮宮素對(duì)人脂肪源干細(xì)胞增殖活性的影響；評(píng)價(jià)縮宮素對(duì)人脂肪源干細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響；檢測(cè)其作用于人脂肪源干細(xì)胞的最低有效濃度。 方法： WST-1：將縮宮素按照不同濃度范圍高濃度組（100nmol.L-1）、中濃度組（50nmol.L-1）、低濃度組（10nmol.L-1），另設(shè)空白對(duì)照組。在1d、7d、14d、為觀察點(diǎn)，用WST-1檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。ELISA：同樣將縮宮素按照高濃度（100nmol.L-1）、中濃度（50nmol.L-1）、低濃度（10nmol.L-1）進(jìn)行分組，另設(shè)空白對(duì)照。在7d和14d用成品試劑盒進(jìn)行堿性磷酸酶活性檢測(cè)。 結(jié)果： WST-1檢測(cè)結(jié)果顯示低濃度縮宮素在第1天、第7天、第14天均略高于對(duì)照組，但沒(méi)有顯著性差異。中濃度和高濃度組在加藥后第一天即表現(xiàn)出對(duì)脂肪干細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，且這種作用隨時(shí)間逐漸明顯，至第14天達(dá)到高峰。另縮宮素對(duì)脂肪干細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用在一定范圍呈劑量依賴(lài)性。ELISA檢測(cè)顯示在第7天，低濃度組的堿性磷酸酶活性略高于對(duì)照組，但沒(méi)有顯著性差異，中濃度和高濃度組堿性磷酸酶活性依次升高，同對(duì)照組相比有顯著性差異。在第14天，中濃度組和高濃度組堿性磷酸酶活性達(dá)到最高，且與對(duì)照組相比有顯著性差異。各組堿性磷酸酶活性隨時(shí)間逐漸升高，且對(duì)縮宮素濃度呈劑量依賴(lài)性。 3二氧化硅介孔材料SBA-15的初步合成及表征 目的：合成SBA-15介孔材料，并對(duì)材料的結(jié)構(gòu)和性能進(jìn)行表征 方法：將P123三嵌段表面活性劑溶于適量去離子水，在35~40攝氏度條件下向體系中加入鹽酸(HCl)和正硅酸乙脂(TEOS)，使用磁力攪拌子持續(xù)劇烈攪拌24小時(shí)以上，將反應(yīng)體系移入乙烯瓶進(jìn)行晶化過(guò)程，72小時(shí)后對(duì)材料進(jìn)行過(guò)濾、洗滌、干燥。550℃焙燒5小時(shí)，并用有機(jī)溶劑反復(fù)沖洗以去除有機(jī)模板劑，最后過(guò)濾、洗滌并干燥、研磨材料，得到的白色粉末即為SBA-15粉末材料。利用元素分析、X線(xiàn)衍射分析、SEM成發(fā)射掃描電鏡、TEM掃描電鏡、氮吸附試驗(yàn)等手段對(duì)材料進(jìn)行表征。 結(jié)果：元素分析顯示合成材料高純度Si-O無(wú)機(jī)物，掃描電鏡下呈直徑20~50微米顆粒，顆粒表面為粗糙的納米結(jié)構(gòu)，透射電鏡下可見(jiàn)顆粒內(nèi)部有大量納米級(jí)孔道結(jié)構(gòu)，XRD檢測(cè)結(jié)果材料結(jié)構(gòu)均一，氮吸附檢測(cè)為IV型吸附曲線(xiàn)，是典型的（直型孔道結(jié)構(gòu)的）介孔材料吸附曲線(xiàn),具有較窄的孔徑分布。最終合成為高純度SiO2介孔材料SBA-15。 4OT在SBA-15材料中的裝載和釋放 目的：以O(shè)T作為藥物模型，研究OT/SBA-15體系的組裝及釋放動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)。 方法：用OT進(jìn)行藥物組裝及釋放的實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)體系最大載藥量、所需的最佳濃度和時(shí)間，以及藥物—載體系統(tǒng)的釋放動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)。 結(jié)果：OT在0.06mol/L濃度下，6小時(shí)即可達(dá)到最大載藥量，約為35%質(zhì)量分?jǐn)?shù)。OT/SBA-15材料體系在釋放過(guò)程的前4小時(shí)，有明顯突釋現(xiàn)象，即有將近40%的藥物釋放。之后的藥物釋放逐漸平緩。至32小時(shí)，有將近90%的藥物全部釋放，釋放過(guò)程基本完成。 5SBA-15生物活性的體內(nèi)、外研究 目的：檢測(cè)SBA-15材料的細(xì)胞毒性及生物相容性 方法：制備不同濃度SBA-15浸提液，MTT檢測(cè)其細(xì)胞毒性；進(jìn)行SBA-15體外溶血實(shí)驗(yàn)；用MG-63人成骨細(xì)胞系進(jìn)行材料直接接觸實(shí)驗(yàn)。分別設(shè)置SBA-15組、OT/SBA-15組、空白對(duì)照組，檢測(cè)其對(duì)人脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞成骨向分化的影響。制造兔顱骨缺損，采用局部注射給藥的形式，通過(guò)鈣鹽沉積量檢測(cè)和組織學(xué)分析，驗(yàn)證SBA-15在體內(nèi)的安全性以及OT/SBA-15載藥體系對(duì)骨缺損修復(fù)的促進(jìn)作用。 結(jié)果：在細(xì)胞毒性檢測(cè)中，2倍至20倍濃度SBA-15材料浸提液均表現(xiàn)無(wú)細(xì)胞毒性。體外溶血實(shí)驗(yàn)中溶血率為3.1%，低于5%，，不會(huì)引起急性溶血反應(yīng)。直接接觸實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞在材料表面生長(zhǎng)狀況良好。SBA-15材料對(duì)人脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨向分化沒(méi)有影響，OT/SBA-15載藥系統(tǒng)明顯促進(jìn)人脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨向分化、增強(qiáng)堿性磷酸酶活性及Ⅰ型膠原活性。SBA-15在體內(nèi)生物安全性良好，沒(méi)有明顯的炎癥反應(yīng)，不會(huì)對(duì)骨缺損的修復(fù)產(chǎn)生影響；負(fù)載縮宮素后的SBA-15能夠再體內(nèi)緩慢釋放藥物，對(duì)骨缺損的修復(fù)有明顯的促進(jìn)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R783.1

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本文編號(hào)：1605239