發(fā)布時間：2018-03-02 11:40

  本文選題：鎂合金　切入點：Ca-P涂層　出處：《吉林大學》2013年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的 以鎂為基質(zhì)的生物材料近幾年以來一直是生物材料研究領(lǐng)域極為活躍的內(nèi)容。以不銹鋼及鈦合金為主的傳統(tǒng)生物材料對現(xiàn)代骨科內(nèi)固定植入材料的發(fā)展發(fā)揮了極大的作用。但傳統(tǒng)骨科植入材料植入體內(nèi)后產(chǎn)生應力遮擋阻礙骨折愈合；骨折愈合后需二次手術(shù)取出；材料取出后易發(fā)生再骨折等問題促使人們尋找可能的替代品。以鎂為基質(zhì)的生物材料由于具有良好的金屬特性、力學性能及可降解性成為現(xiàn)在研究的熱點，并極有可能成為新的骨科植入材料。 鎂基質(zhì)材料耐腐蝕性低，腐蝕過程中會有大量的H2產(chǎn)生，這些都限制了鎂基質(zhì)材料作為生物材料的應用。如何在提高以鎂基質(zhì)材料的耐腐蝕性的同時又能保證鎂基質(zhì)材料的生物力學特性和生物相容性，這是現(xiàn)階段研究的熱點。其主要研究內(nèi)容有：（1）鎂與其他一種或多種金屬形成合金。常見的金屬元素有錳、鋅、鋁、鈣和稀土元素等。合成后的鎂合金材料抗腐蝕性能較純鎂材料有了很大的提高，但作為生物可植入材料，其生物相容性表現(xiàn)并不理想。（2）另一種常用方法為在鎂合金材料表面進行表面改性、增加表面涂層或表面保護膜。Ca和P都是骨基質(zhì)的主要組成成分，研究結(jié)果顯示Ca-P涂層具有良好的生物相容性，并有很好的骨傳導性和誘骨活性。Ca-P涂層尤其是HA涂層在鈦合金假體中已廣泛應用于臨床。為此，我們設(shè)計了一種簡單有效地化學方法，對鎂鋁合金（AZ60）進行表面修飾，制得Ca-P涂層覆于鎂合金材料表面，然后對制得的含有Ca-P涂層的鎂合金材料進行初步的生物相容性實驗研究：評價含有Ca-P涂層的鎂合金在SBF溶液中的耐腐蝕性；評價含有Ca-P涂層的鎂合金的細胞毒性；評價含有Ca-P涂層的鎂合金植入動物體內(nèi)的生物相容性。 方法 SBF溶液中的抗腐蝕實驗 將有Ca-P涂層與無涂層的兩種鎂合金材料浸入配置好的SBF溶液中，溫度維持在37±1°C，材料表面積與SBF溶液的體積比為1cm2/20mL。分別在反應后1d、3d、7d、14d與21d檢測溶液中pH和Mg、Ca離子濃度的變化。體外細胞毒性實驗 實驗設(shè)為3組:A組，無Ca-P涂層材料組；B組，含有Ca-P涂層材料組；C組，陰性對照組 材料浸提液的制備 按照國際標準化組織的的標準（EN ISO10993-2009）進行。將A、B兩組不同的材料放置于DMEM細胞培養(yǎng)液中，其材料面積與細胞培養(yǎng)液比例為1cm~2/ml。將其置于（37±1）°C的環(huán)境下24h后制得材料浸提液。 利用96孔板將MC3T3-E1成骨細胞與兩組材料的DMEM浸提液培養(yǎng)，陰性對照組為DMEM細胞培養(yǎng)液。培養(yǎng)1d、3d、5d、7d后觀察細胞生長狀況，CCK-8法測定細胞增殖活性，用酶標儀在450nm處記錄各孔吸光度值（OD），計算材料浸提液對細胞的毒性。 利用24孔板將MC3T3-E1成骨細胞與兩組材料的DMEM浸提液培養(yǎng)，陰性對照組為DMEM培養(yǎng)液。培養(yǎng)5d后將事先放置于孔底的載玻片取出，酒精固定，HE染色，光鏡下觀察細胞在不同培養(yǎng)液里的生長情況，觀察有無細胞形態(tài)和胞核、胞質(zhì)的改變。 利用24孔板將MC3T3-E1成骨細胞與兩組材料的DMEM浸提液培養(yǎng)，陰性對照組為DMEM培養(yǎng)液。培養(yǎng)五天后應用p-NPP法測定細胞堿性磷酸酶量，記錄酶標儀在410nm處各孔吸光度值（OD），計算ALP活性，從而評價細胞分化增殖活性。 利用6孔板將MC3T3-E1成骨細胞與兩組材料直接接觸培養(yǎng)，陰性對照組為DMEM細胞培養(yǎng)液。培養(yǎng)5d后將在A、B兩組材料取出，收集各孔中細胞，利用細胞凋亡檢測試劑盒進行雙染，應用流式細胞儀記錄細胞凋亡情況。體內(nèi)材料植入生物相容性實驗 實驗分為3組，A組，無涂層鎂合金材料組；B組，Ca-P涂層鎂合金材料組；C組，不銹鋼材料組。 選取36只成年新西蘭大白兔，體重在2.5-3.0Kg之間，雌雄不限。隨機分為3組，，每組12只。在其兩側(cè)股骨髁外側(cè)植入直徑3mm，長8mm的圓柱形內(nèi)置物。術(shù)后觀察動物的精神狀態(tài)、活動、進食、創(chuàng)口愈合及皮下氣腫等情況。分別于術(shù)后1mon、2mon和3mon空氣栓塞處死12只兔子，每組4只，獲得含有內(nèi)置物的標本每組8個。將每組2個標本中的內(nèi)置物取出，測重，剩余骨組織進行脫鈣、固定后染色、觀察內(nèi)置物周圍骨組織的細胞結(jié)構(gòu)變化；3個含有內(nèi)置物的標本行Micro-CT檢查；3個含有內(nèi)植物的標本行硬組織切片檢查，立春紅染色，觀察內(nèi)置物周圍骨組織結(jié)構(gòu)的變化。 結(jié)果 SBF溶液內(nèi)材料耐腐蝕性實驗 無Ca-P涂層的鎂合金材料放入SBF溶液后降解速度很快，材料周圍可見大量氣泡產(chǎn)生，其溶液內(nèi)Mg離子濃度從初始濃度1.5mmol/L，24小時后攀升到3.5mmol/L，48小時后Mg離子濃度上升到4.8mmol/L。相對于無涂層鎂合金材料的較快的腐蝕速率，含有Ca-P涂層的鎂合金材料置于SBF溶液中24小時后Mg離子濃度僅僅上升了0.2mol/L為1.7mol/L，最高濃度變化為72小時2.1mmol/L。Mg離子濃度的變化基本與溶液內(nèi)pH值變化相對應。兩組材料在SBF溶液中的抗腐蝕性能有顯著差異（p0.05）,說明Ca-P涂層的存在對增加鎂合金材料的抗腐蝕性起了很大的作用。 陰性對照組與含有Ca-P涂層鎂合金材料組OD值無明顯差別，但與無涂層鎂合金材料組間有明顯差異。（p0.05）說明含有Ca-P涂層鎂合金材料對MC3T3-E1成骨細胞生長沒有明顯的細胞毒性。 光鏡下觀察到含有Ca-P涂層的鎂合金材料組MC3T3-E1成骨細胞生長狀態(tài)與形態(tài)結(jié)構(gòu)與陰性對照組內(nèi)細胞生長狀態(tài)與形態(tài)結(jié)構(gòu)無明顯差異，細胞生長狀態(tài)及分化增殖情況正常，未見明顯的細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。反觀無涂層鎂合金材料組MC3T3-E1成骨細胞生長情況，細胞生長抑制明顯，分化和增值差，細胞形態(tài)與結(jié)構(gòu)變化較大。 應用p-NPP法對三組培養(yǎng)細胞的ALP活性進行檢測結(jié)果顯示:含有Ca-P涂層鎂合金材料組與陰性對照組內(nèi)細胞ALP活性表達較高，分別達到了10.4和10.7nol/min/mg prote,而無涂層鎂合金材料組細胞ALP活性僅為6.4nol/min/mg prote.Ca-P涂層鎂合金材料與無涂層鎂合金材料組之間差異明顯。 利用AnnexinV-FITC/PI細胞雙染法經(jīng)流式細胞儀計數(shù)后可以明顯的觀察的A組即無涂層的鎂合金材料組細胞數(shù)量較另外兩組細胞數(shù)量減少明顯。測得3組細胞凋亡率分別為A組（無涂層組），30.8%；B組（含有涂層組），17.82%；C組（陰性對照組），19.33%。其中含有Ca-P涂層鎂合金材料組的細胞凋亡率與無涂層組細胞凋亡率差異明顯，甚至其細胞凋亡率低于正常對照組，說明Ca-P涂層在一定程度上有利于成骨細胞的增殖與分化。體內(nèi)生物相容性實驗 術(shù)后所有大白兔麻醉清醒后活動良好，進食正常，術(shù)后創(chuàng)口愈合良，未見明顯的皮下氣腫。術(shù)后兩周無涂層材料組一只大白兔出現(xiàn)了厭食，活動減少，消瘦等癥狀，術(shù)后1個月處死后發(fā)現(xiàn)其右側(cè)手術(shù)肢體創(chuàng)口位置有一巨大的軟組織腫物，腫物內(nèi)為乳白色干酪樣物質(zhì)。 將標本內(nèi)取出的內(nèi)置物經(jīng)室溫干燥后稱重，并與術(shù)前質(zhì)量相比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)術(shù)后1個月與2個月內(nèi)有涂層組與無涂層組的質(zhì)量變化不明顯。術(shù)后3個月時兩組材料前后雖有質(zhì)量變化，但兩組間相比較，并沒有明顯的差異。 將植入后1個月和3個月的兔股骨髁部標本進行了Micro-CT檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)植入一個月后，不銹鋼組與Ca-P涂層鎂合金材料組中內(nèi)置物材料與周圍骨組織間接觸緊密，未見明顯的空隙，邊緣較規(guī)則平滑。無涂層鎂合金組內(nèi)可見內(nèi)置物與周圍骨組織間有空隙，邊緣亦見點狀的腐蝕部位。術(shù)后3個月的標本Micro-CT掃描可見不銹鋼材料組較1個月時無明顯變化，材料周圍有少量新骨形成但周圍骨小梁結(jié)構(gòu)排列紊亂；含有Ca-P涂層鎂合金材料組內(nèi)材料未見明顯降解跡象，材料周圍見有較多的新骨形成，并與材料結(jié)合緊密，骨小梁結(jié)構(gòu)排列均勻有序；無涂層鎂合金材料組可見材料降解明顯，材料與周圍骨組織間有較大空隙，內(nèi)為無定形物質(zhì)和少量的纖維組織，周圍未見明顯的新骨形成。 利用3D重建技術(shù)對內(nèi)置物及其周圍的骨組織進行重建，計算材料周圍骨組織的BMD值，含有Ca-P涂層的鎂合金材料周圍與不銹鋼材料周圍的骨組織BMD值明顯高于無涂層鎂合金材料周圍骨組織的BMD值，BMD值越大說明成骨能力越好，骨組織細胞代謝旺盛。通過系統(tǒng)軟件計算內(nèi)置物材料的腐蝕速度。A組材料術(shù)后1個月時腐蝕率為0.079mm/a,術(shù)后3個月時為0.197mm/a；B組材料術(shù)后1個月時腐蝕率為0.024mm/a術(shù)后3個月時為0.058mm/a；C組材料腐蝕率為0。A、B兩組間腐蝕率比較有明顯的差異性（P0.05）。 含有內(nèi)置物的標本切片后行利春紅染色，觀察材料表面的骨小梁結(jié)構(gòu)生長和變化情況。光鏡下觀察B、C兩組材料周圍有清晰的新的骨小梁結(jié)構(gòu)產(chǎn)生，骨小梁結(jié)構(gòu)致密、粗大，B組材料周圍骨小梁結(jié)構(gòu)與材料表面結(jié)合緊密,骨小梁排列整齊有序。A組材料周圍骨小梁結(jié)構(gòu)稀疏，周圍空隙較大，并含有大量的無定形物質(zhì)，偶有骨組織與材料接觸。 結(jié)論 含有Ca-P涂層鎂合金材料可以明顯的提高材料的抗腐蝕性。 含有Ca-P涂層鎂合金材料無明顯細胞毒性，且能促進成骨細胞的增殖分化。 體內(nèi)植入后，含有Ca-P涂層鎂合金材料具有很好的抗腐蝕性能，并表現(xiàn)出較好的生物相容性和骨誘導活性。 本研究為Mg合金Ca-P涂層作為骨科內(nèi)置物應用提供了生物安全性實驗依據(jù)，為進一步研究提供了理論支持。 含有Ca-P涂層的鎂合金材料（AZ60）具有成為新一代骨科可降解植入材料的可能。
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【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R318.08

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 任伊賓,黃晶晶,楊柯,張炳春,姚治銘,王浩;純鎂的生物腐蝕研究[J];金屬學報;2005年11期

2 鄭玉峰;顧雪楠;李楠;周維瑞;;生物可降解鎂合金的發(fā)展現(xiàn)狀與展望[J];中國材料進展;2011年04期

本文編號：1556368