本文關(guān)鍵詞： 骨組織工程 微構(gòu)重塑技術(shù) 微組織 人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞 成骨分化　出處：《華東理工大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：基于傳統(tǒng)技術(shù)體外構(gòu)建的工程化組織,由于物質(zhì)傳遞受限使得三維構(gòu)建物中細(xì)胞和胞外基質(zhì)分布不均,細(xì)胞主要生長在支架的表層區(qū)域,構(gòu)建物內(nèi)部因氧和營養(yǎng)物質(zhì)供給不足、細(xì)胞代謝副產(chǎn)物難以排出而出現(xiàn)壞死區(qū),無法形成尺寸突破厘米級(jí)的工程化組織,遠(yuǎn)不能滿足臨床的需要。組織微構(gòu)重塑技術(shù)是指通過制備模擬體內(nèi)組織結(jié)構(gòu)功能單位的微組織并將其裝配形成工程化組織的一項(xiàng)新技術(shù),為解決體外構(gòu)建大尺寸工程化組織提供了新思路。本文以體外構(gòu)建工程化骨組織為研究對象,從降低或消除工程化組織體外構(gòu)建過程中的傳質(zhì)限制出發(fā),重點(diǎn)研究基于人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞(hAMSCs)體外擴(kuò)增和定向誘導(dǎo)分化的組織微構(gòu)重塑技術(shù),以建立厘米級(jí)大型骨組織的體外構(gòu)建技術(shù)和方法,為未來大型組織替代物的體外構(gòu)建和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。首先,建立了在轉(zhuǎn)瓶中應(yīng)用CultiSpher S微載體培養(yǎng)和擴(kuò)增hAMSCs的懸浮培養(yǎng)體系,并考察了微載體種類、細(xì)胞接種密度、攪拌轉(zhuǎn)速和微載體濃度等對細(xì)胞在微載體上生長和代謝的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,CultiSpher S微載體更適合支持hAMSCs生長；當(dāng)細(xì)胞接種密度為0.5×105cells/ml、攪拌轉(zhuǎn)速為50 r/min、微載體濃度為2.0 mg/ml時(shí),hAMSCs在微載體上增殖8d后進(jìn)入穩(wěn)定期,最高細(xì)胞密度可達(dá)(29.6±3.7)×106cells/cm3,最大擴(kuò)增倍數(shù)達(dá)到14.7士1.8。在此基礎(chǔ)上,采用該培養(yǎng)方法建立了集干細(xì)胞生長擴(kuò)增和成骨誘導(dǎo)分化為一體的骨微組織制備技術(shù)。研究結(jié)果表明,接種后細(xì)胞在生長階段增殖迅速,至8d時(shí)細(xì)胞約擴(kuò)增15倍,最大細(xì)胞密度可達(dá)(29.3±2.2)×106cells/cm3。更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)20 d后細(xì)胞中堿性磷酸酶活性及鈣沉積量顯著增加。通過細(xì)胞生長-分化二段式培養(yǎng)后,hAMSCs可成功在Cultishpher S微載體上擴(kuò)增分化并形成具有成骨表型的微組織,可作為構(gòu)建單元用于下一步工程化組織的構(gòu)建。利用自制的灌注培養(yǎng)裝配裝置,將骨微組織塑形并灌注培養(yǎng)7d后形成了直徑2.0 cm、厚度1.0 cm的圓柱狀組織。該工程化組織表面基質(zhì)分泌豐富,微組織結(jié)合緊密；組織內(nèi)部活細(xì)胞分布均勻,但微組織之間結(jié)合較疏松,其間的空隙未被細(xì)胞和胞外基質(zhì)完全填充；檢測顯示該組織可表達(dá)成骨分化表型。由此可見,基于組織微構(gòu)重塑技術(shù)體外構(gòu)建厘米級(jí)工程化骨組織是完全可行的。為了提高工程化組織中的細(xì)胞密度,促進(jìn)胞外基質(zhì)分泌,提高其組織的完整性和成骨特性,本文在組織制備過程中考察了小分子化合物抗壞血酸鹽和巰基乙醇添加濃度對hAMSCs生長、基質(zhì)沉積和成骨分化的影響。結(jié)果顯示,孔板生長培養(yǎng)基中添加的抗壞血酸鹽對hAMSCs生長有抑制作用,且隨著抗壞血酸鹽濃度的增加,其抑制作用增強(qiáng)。但添加巰基乙醇能使細(xì)胞生長較快進(jìn)入穩(wěn)定期,且當(dāng)巰基乙醇添加濃度為50～100 μmol/L時(shí)可顯著促進(jìn)hAMSCs增殖。在成骨定向誘導(dǎo)分化階段,抗壞血酸鹽的添加濃度大于或等于100 μg/ml時(shí)hAMSCs成骨特性降低,而巰基乙醇添加量達(dá)50 μmol/L或以上時(shí)則可促進(jìn)hAMSCs的鈣基質(zhì)沉積。為進(jìn)一步提高微組織的性能,以濃度為50 μg/ml抗壞血酸鹽和50 μmol/L巰基乙醇作為添加劑,考察在微組織制備過程中上述添加劑對hAMSCs細(xì)胞增殖、基質(zhì)分泌和成骨分化的影響,以及上述不同條件制備的微組織裝配形成的工程化骨組織結(jié)構(gòu)和性能差異。結(jié)果顯示,添加抗壞血酸鹽對細(xì)胞增殖及胞外基質(zhì)表達(dá)無明顯促進(jìn)作用,但添加巰基乙醇不僅能促進(jìn)細(xì)胞增殖,而且有利于微載體聚集成粒徑800～900μm的聚團(tuán),這些聚團(tuán)經(jīng)過20 d的成骨誘導(dǎo)后能夠成為具有顯著成骨特征的骨微組織,將其裝配塑形并灌注培養(yǎng)7d后,形成了直徑20 mm、高10mm的大尺寸工程化骨組織,其中的細(xì)胞密度、細(xì)胞活性及胞外基質(zhì)分泌沉積等顯著高于對照組和抗壞血酸鹽組,說明添加巰基乙醇不僅能促進(jìn)細(xì)胞增殖,而且還能增強(qiáng)工程化組織的成骨表型。最后,本文還考察了在微組織裝配形成大組織的過程中體外灌注培養(yǎng)時(shí)間對工程化組織性能的影響,并采用皮下移植實(shí)驗(yàn)分析其體內(nèi)成骨能力。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)灌注培養(yǎng)時(shí)間延長至2周時(shí),工程化組織中的細(xì)胞活性、組織結(jié)構(gòu)及成骨分化等性能均有顯著提升。皮下移植實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,灌注2周形成的組織在小鼠體內(nèi)能夠更好地維持移植物的形態(tài)、組織活性和胞外基質(zhì)沉積。綜上所述,本文利用人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞和大孔CuitiSpher S微載體,在轉(zhuǎn)瓶微載體懸浮培養(yǎng)體系中成功建立了集干細(xì)胞生長-分化為一體的微組織制備方法,并通過在微組織制備過程中添加巰基乙醇這一小分子化合物,顯著提高了微組織細(xì)胞密度,促進(jìn)了基質(zhì)分泌和組織形成。采用自制的灌注塑形培養(yǎng)裝置經(jīng)體外裝配后,構(gòu)建形成了突破傳質(zhì)限制尺寸、高細(xì)胞活性、胞外基質(zhì)分布均一的厘米級(jí)工程化骨組織,該組織在體內(nèi)可維持生理生化特性。以上結(jié)果說明,組織微構(gòu)重塑技術(shù)是一種行之有效、富有潛力的體外組織構(gòu)建方法,它為未來大型工程化組織的體外構(gòu)建提供了新的途徑和方法,也為加快組織工程產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化和臨床應(yīng)用創(chuàng)造了條件。
[Abstract]:In vitro construction of engineered bone tissue ( hAMSCs ) is a new technique in vitro construction and clinical application of human amniotic mesenchymal stem cells ( hAMSCs ) . The results showed that the growth of hAMSCs was not only promoted by adding ascorbic acid salt to 50 渭mol / ml ascorbic acid salt and 50 渭mol / L mercapto ethanol . It also creates conditions for speeding up the industrialization and clinical application of tissue engineering products .

【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R318

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