本文關(guān)鍵詞： 短肽 BMP-2 nHAC/PLLA 骨缺損 骨修復(fù)　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景世界范圍內(nèi),由創(chuàng)傷、腫瘤和感染等原因引起的骨缺損正逐年增加,對(duì)人們的健康產(chǎn)生越來(lái)越大的影響。在我國(guó),由于骨缺損而需要接受治療的患者每年大約有400萬(wàn)。除了疾病引起的骨缺損需要骨移植外,整形美容外科手術(shù)中也經(jīng)常需要骨移植來(lái)塑形[1]。骨移植材料已成為僅次于輸血的需求量最大的移植物,而且有逐年增多的趨勢(shì)。迄今為止,自體骨移植作為金標(biāo)準(zhǔn)廣泛應(yīng)用于臨床,但是其存在來(lái)源有限和供區(qū)功能缺失的問(wèn)題,并且取骨的過(guò)程會(huì)造成患者持續(xù)疼痛、神經(jīng)損傷和新的骨折等,限制其臨床應(yīng)用;同種異體骨因存在免疫反應(yīng)和傳播疾病的危險(xiǎn),也限制其在臨床的應(yīng)用。因此,研制理想的骨移植物修復(fù)骨缺損成為醫(yī)學(xué)和生物材料科學(xué)領(lǐng)域中的重要課題。理想的骨移植材料應(yīng)該具有良好的生物相容性、可降解性、骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性[2]。在過(guò)去的10年間,研究的熱點(diǎn)集中在骨移植材料的設(shè)計(jì)和體內(nèi)外應(yīng)用上,已有許多研究者研發(fā)了多種骨修復(fù)材料。天然骨主要由磷灰石和膠原組成。因此,由羥基磷灰石和膠原組成的骨修復(fù)材料研究廣泛。通過(guò)自組裝的方法,清華大學(xué)的崔福齋教授課題組研制出一種新型的納米羥基磷灰石/膠原(nHAC)材料。通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明,該材料無(wú)論是在結(jié)構(gòu)上,還是在成分上,可以媲美天然骨組織。Nature Materials曾發(fā)表評(píng)論:崔教授課題組的工作是具有開創(chuàng)性的工作。他們找到了用仿生自組裝制造生物材料的新方法。同時(shí),骨礦化膠原的分級(jí)結(jié)構(gòu)理論在實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。聚乳酸(PLLA)具有無(wú)毒性和可降解性,被廣泛應(yīng)用于骨組織工程支架材料的研究,并被美國(guó)食品與藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)廣泛用作手術(shù)縫合線、體內(nèi)支架,并可以作為藥物控釋載體[1]。由nHAC和PLLA構(gòu)成的新型骨組織工程材料nHAC/PLLA已成功制備。其構(gòu)成和分級(jí)的微觀結(jié)構(gòu)都類似天然骨組織,可以提高細(xì)胞的粘附力、刺激細(xì)胞增殖和分布。自2011年被食品和藥品監(jiān)督局批準(zhǔn)注冊(cè)證以來(lái),臨床已應(yīng)用上萬(wàn)例,臨床數(shù)據(jù)顯示其具有廣闊的臨床應(yīng)用價(jià)值。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMPs)最早由Urist發(fā)現(xiàn)并命名。BMPs是一組具有類似結(jié)構(gòu)的高度保守的功能蛋白,屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)超家族。近些年的研究發(fā)現(xiàn),BMPs有多種生物學(xué)功能。其最為研究者關(guān)注的功能為其能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)骨和軟骨形成。無(wú)論是在肢體生長(zhǎng)、軟骨內(nèi)骨化等生理狀態(tài)下,還是在骨折后修復(fù)、軟骨損傷后修復(fù)等病理狀態(tài)下,均可表達(dá)。在骨骼的胚胎發(fā)育以及骨折后的修復(fù)中均起到重要作用。BMP-2是目前研究最為廣泛、誘導(dǎo)成骨活性最強(qiáng)的BMPs之一。天然的BMP-2雖然具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)成骨的能力,但存在數(shù)量有限,價(jià)格較高等問(wèn)題。臨床上通過(guò)載體負(fù)載應(yīng)用BMP-2,在和載體負(fù)載后,帶來(lái)很多問(wèn)題。例如,分子的活性在有些情況下會(huì)受到干擾。如大分子蛋白質(zhì)吸附在材料表面后會(huì)隨機(jī)折迭,使活性位點(diǎn)難以暴露,降低其生物活性;另外,難以持續(xù),緩慢釋放。在生物環(huán)境中早期突釋,隨后濃度迅速下降,達(dá)到治療水平以下,作用時(shí)間短暫。經(jīng)過(guò)美國(guó)FDA認(rèn)證的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(rhBMP-2)在工藝,質(zhì)控,安全性方面還存在各種問(wèn)題,無(wú)法大規(guī)模的生產(chǎn)[3]。清華大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院生物材料組組根據(jù)BMP2的活性核苷酸序列,用化學(xué)合成法合成含有17個(gè)氨基酸的新型短肽P17-BMP-2。該短肽克服了國(guó)內(nèi)外基因工程技術(shù)制備的rhBMP-2的缺點(diǎn)。其與BMP2的骨誘導(dǎo)活性相類似,同時(shí)應(yīng)用了固相合成法,工藝更為簡(jiǎn)單,可以用多肽合成儀大量制備。解決了 rhBMP-2無(wú)法大規(guī)模生產(chǎn)以及安全性的難題。P17-BMP-2僅含有17個(gè)氨基酸,可以有效地克服大分子所帶來(lái)的抗原性以及其他一些生物副作用。結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,生物性狀更加穩(wěn)定,活性更好。而且,非常方便對(duì)該肽鏈進(jìn)行修飾�？梢哉f(shuō),該核苷酸序列繼承了 BMP-2的活性,克服了其缺點(diǎn)。因此,本課題將清華大學(xué)饋贈(zèng)的新型短肽P17-BMP-2與高誘導(dǎo)性膠原基納米羥基磷灰石骨材料(nHAC/PLLA)復(fù)合,通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),研究新型短肽P17-BMP-2體外誘導(dǎo)成骨能力,及將其負(fù)載到nHAC/PLLA上后,通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn),研究該種新材料在促進(jìn)骨缺損修復(fù)過(guò)程中的作用及變化,為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。研究目的1.利用固相多肽合成法合成含有17個(gè)氨基酸的新型短肽P17-BMP-2.2.研究P17-BMP-2的誘導(dǎo)成骨的能力3.利用吸附法將短肽P17-BMP-2負(fù)載于膠原基納米羥基磷灰石復(fù)合材料中(nHAC/PLLA)。4.檢測(cè)負(fù)載P17-BMP-2短肽的材料的體外控釋效果。5.通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和兔體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證負(fù)載P17-BMP-2短肽的材料的體內(nèi)外誘導(dǎo)成骨能力。研究方法1新型短肽P17-BMP-2的制備首先通過(guò)固相多肽合成法(FMOC/tBU)合成粗肽。通過(guò)凝膠過(guò)濾層析初步純化粗肽,通過(guò)高效液相色譜法再次純化,最后由質(zhì)譜儀檢測(cè)確定短肽序列。2 P17-BMP-2體外誘導(dǎo)活性實(shí)驗(yàn)取培養(yǎng)第2、3周細(xì)胞,根據(jù)堿性磷酸酶(AKP)測(cè)定試劑盒,檢測(cè)各組AKP的含量。3.新型短肽P17-BMP2與支架材料nHAC/PLLA的復(fù)合掃描電鏡,透射電鏡下觀察支架材料nHAC/PLLA無(wú)菌條件下,將P17-BMP-2溶于去離子水,調(diào)節(jié)到所需濃度(2mg/ml和10mg/ml)。納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸材料(nHAC/PLLA)(5×5×5mm)分別浸漬到P17-BMP-2溶液,輕輕攪拌2小時(shí)200rpm。真空干燥,烘干、冷凍、消毒。4.將p17-bmp-2負(fù)載于nHAC/PLLA,同種異體骨,可吸收膠原蛋白海綿,應(yīng)用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒,比較緩釋活性。5.復(fù)合短肽nHAC/PLLA上培養(yǎng)細(xì)胞的活性檢測(cè)將鼠MSC種植于各組材料上,分別于種植2、4、6天后,通過(guò)MTT法檢測(cè)各組材料上鼠MSC的增殖情況。細(xì)胞PI染色,激光共聚焦檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。6動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為四組,每組5只:A:空白對(duì)照不植入材料,B:nHAC/PLLA,C:nHAC/PLLA/P17-BMP-2(2mg/g),D:nHAC/PLLA/P17-BMP-2(10mg/g)。在下頜體制備極限骨缺損(10mm×5mm×5mm)的非貫穿骨缺損,保留頰舌側(cè)骨皮質(zhì)。7影像學(xué)分析取術(shù)后2,4周不同時(shí)期的動(dòng)物標(biāo)本,行X線檢查。根據(jù)Lane-SandhuX線評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)法,對(duì)骨愈合過(guò)程中的骨癡量、骨連接、骨塑形等情況進(jìn)行綜合評(píng)分,客觀評(píng)估新骨形成的情況。8組織學(xué)分析骨材料分別在植入后2,4周處死動(dòng)物,完整取下術(shù)區(qū)下頜骨,4℃固定于含有4%的多聚甲醛和0.2%苦味酸,pH= 7.4的0.1M磷酸鹽緩沖液中7天,并在pH=7.5,20%EDTA溶液中脫鈣8周,后流水沖洗12h以上。經(jīng)過(guò)脫水、透明,石蠟包埋后,連續(xù)切取5μm組織片10張,進(jìn)行組織學(xué)染色(H.E.)。采用Lane and Sandhu開發(fā)的組織學(xué)評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。研究結(jié)果1.高壓液相色譜儀顯示合成肽的純度為96%,質(zhì)譜圖顯示合成肽的平均分子量為2023.67m/z,與理論上設(shè)計(jì)多肽的平均分子量一致,短肽序列正確,滿足實(shí)驗(yàn)需求。2.堿性磷酸酶結(jié)果顯示:隨時(shí)間延長(zhǎng),各組材料中堿性磷酸酶含量逐漸增高。在第2周和第3周時(shí),含有10ug/ml新型短肽材料略低于陽(yáng)性對(duì)照組。各實(shí)驗(yàn)組堿性磷酸酶含量明顯高于陰性對(duì)照組。同一時(shí)間點(diǎn),含有30ug/mlP17-BMP-2的材料組堿性磷酸酶含量明顯優(yōu)于其他組。3.電鏡觀察nHAC/PLLA,可見(jiàn)不規(guī)則排列的孔隙結(jié)構(gòu)4.P17-BMP-2負(fù)載于nHAC/PLLA,緩釋效果優(yōu)于同種異體骨5.MTT結(jié)果顯示各組材料隨著時(shí)間的推移細(xì)胞數(shù)量逐漸增加,活性增強(qiáng)。含有10mg/g短肽P17-BMP-2的材料組細(xì)胞活性最強(qiáng)。細(xì)胞染色后,激光共聚焦檢測(cè)顯示10mg/g短肽P17-BMP-2的材料組細(xì)胞活性最強(qiáng)。6.影像學(xué)分析結(jié)果顯示:術(shù)后2周時(shí),空白對(duì)照組未見(jiàn)有骨密度影形成,植入骨修復(fù)材料組均可見(jiàn)低密度影形成,且復(fù)合新型短肽的材料組密度影比對(duì)空白對(duì)照組和單純材料組密度影要深。術(shù)后4周,各組密度影都比術(shù)后2周時(shí)加深,并且面積增大�？瞻讓�(duì)照組密度影加深但是不連續(xù)。復(fù)合新型短肽含量高的密度影最深面積基本完全充滿缺損部位。根據(jù)Lane-Sandhu X射線評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算結(jié)果顯示術(shù)后4周的分值明顯高于術(shù)后2周。且隨著復(fù)合新型短肽P17-BMP-2的含量的增多其分值越高。7.組織學(xué)分析結(jié)果顯示:術(shù)后2周,A組(空白對(duì)照組)在缺損區(qū)邊緣處有纖維結(jié)合,見(jiàn)成纖維細(xì)胞形成。B組(單純材料組)可見(jiàn)兔宿主骨組織與植入材料結(jié)合部位開始模糊,有纖維連接,大量結(jié)締組織形成。并且結(jié)締組織、成纖維細(xì)胞長(zhǎng)入材料深部,但未長(zhǎng)滿材料。材料與宿主骨交界處可見(jiàn)小血管形成,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)材料。材料有輕微降解。C組和D組(植入復(fù)合新型短肽P17-BMP-2的材料組),可見(jiàn)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),成纖維細(xì)胞、結(jié)締組織形成,纖維連接更明顯,有大量小血管生成和骨母細(xì)胞長(zhǎng)入,隨著新型短肽含量增多可見(jiàn)有早期骨形成和活躍的新骨化組織形成,可見(jiàn)材料有輕微降解。術(shù)后4周,A組(空白對(duì)照組),可見(jiàn)明顯纖維連接,有活躍的新骨形成。B組(植入nHAC/PLLA材料組)有少量炎性反應(yīng),結(jié)締組織,大量纖維連接在宿主骨與植入材料交界處形成,有大量小血管形成,并且有活躍的新骨形成,少量骨聚集。可見(jiàn)材料明顯降解。C組和D組(植入復(fù)合新型短肽P17-BMP-2的材料組)可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)比2周時(shí)明顯減少,有大量活躍的新骨形成,并且隨著新型短肽含量增多新骨形成增多,并且新骨聚集形成新的骨化結(jié)構(gòu)。宿主骨與新形成的骨形成連接界限模糊,可見(jiàn)早期皮質(zhì)骨形成�？梢�(jiàn)植入材料明顯降解。根據(jù)Lane-Sandhu組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算分析結(jié)果顯示,術(shù)后4周骨缺損修復(fù)顯著優(yōu)于術(shù)后2周時(shí)的修復(fù),組織學(xué)評(píng)分均值差異,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.001)。術(shù)后4周,D組骨缺損修復(fù)明顯優(yōu)于其他各組。結(jié)論1利用固相多肽合成法合成含有17個(gè)氨基酸的新型短肽P17-BMP-2,序列正確。2新型短肽P17-BMP-2體外具有促進(jìn)鼠MSC增殖的活性并且誘導(dǎo)鼠MSC分化成骨。3.P17-BMP-2負(fù)載于nHAC/PLLA有較好的緩釋效果。4.nHAC/PLLA與新型短肽P17-BMP-2復(fù)合后能有加速誘導(dǎo)骨修復(fù),可以為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論支持。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R318.08

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本文編號(hào)：1487500