本文關(guān)鍵詞： 骨髓間充質(zhì)干細胞 可注射 軟骨缺損修復(fù) 溫度敏感 水凝膠　出處：《吉林大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景知識： 軟骨缺損的修復(fù)對醫(yī)生和科學(xué)家來說是一個巨大挑戰(zhàn)。由軟骨缺損引起的關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙給千萬患者帶來巨大的痛苦。由于軟骨無血管的結(jié)構(gòu)以及軟骨細胞遷徙能力差，致使軟骨很難自我修復(fù)。關(guān)節(jié)軟骨為透明軟骨，光滑而富有彈性，可以最大緩沖壓力的吸收。臨床常用的軟骨修復(fù)方法是鉆孔至軟骨下骨或微骨折等骨髓刺激方法，旨在促進血液中的干細胞向病變部位聚集。然而，修復(fù)后的組織主要是纖維軟骨，和透明軟骨相比機械性能較低，并最終導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎。 如今對軟骨再生較有前景的方法為細胞治療。軟骨細胞起源于骨髓間充質(zhì)干細胞（BMMSCs）。近年來由于種子細胞的自我復(fù)制和多向分化的能力，間充質(zhì)干細胞被廣泛使用。特別是BMMSCs因其微創(chuàng)方法便可提取，以及體外增殖容易而最接近臨床應(yīng)用。BMMSCs可保持穩(wěn)定分化成軟骨細胞的能力，是終生可用的軟骨前體細胞。此外，與脂肪間充質(zhì)干細胞相比，高密度的BMMSCs在三維培養(yǎng)中可明顯促進產(chǎn)生軟骨的分化。 由于三維支架培養(yǎng)的BMMSCs可以促進軟骨形成，多種生物材料已被開發(fā)用于軟骨組織工程。在軟骨中，II型膠原和蛋白聚糖形成三維結(jié)構(gòu)，大部分由液體填充，這類似于同樣可以吸收大量水分的水凝膠三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。因此在過去的幾十年，水凝膠在軟骨再生領(lǐng)域處于重要角色，并將繼續(xù)引領(lǐng)未來。特別是溫敏水凝膠已備受關(guān)注，由于其獨特的可注射性，在體溫時溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變，無需任何其他的觸發(fā)點。合成溫敏水凝膠可以控制它們的機械性能，對軟骨修復(fù)的生物力學(xué)負載非常重要。聚丙交酯乙交酯（PLGA）是一種疏水性的官能聚合物，它具有良好的生物降解性及生物相容性，已被FDA批準可用于臨床。最值得一提的是，PLGA的降解產(chǎn)物谷氨酸是關(guān)節(jié)軟骨中含量最高的氨基酸。聚乙二醇（PEG）是一種水溶性好、無毒的親水性聚合物�；谶@些聚合物，PLGA PEG PLGA三嵌段共聚物是具有良好的生物降解性和生物相容性，是一種有前途的溫敏材料。 材料與方法： 在本研究中，我們通過PEG引發(fā)乳酸（LA）和乙醇酸（GA）的開環(huán)聚合制備了4種具有不同分子量的PLGA PEG PLGA三嵌段共聚物，并通過核磁共振氫譜、傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜、凝膠滲透色譜、臨界膠束濃度、透射電子顯微鏡、動態(tài)光激光光散射等一系列檢測對上述共聚物以及其在水環(huán)境中完成自組裝后所形成的高分子膠束表征了其化學(xué)結(jié)構(gòu)和組成。通過小瓶倒置法和流變實驗研究了PLGA PEG PLGA的成膠性能。體外溶蝕實驗和體內(nèi)降解實驗研究了其生物降解性能。噻唑藍實驗、細胞粘附和增殖實驗來驗證生物相容性及細胞生存增殖能力。選取雄性中國大白兔（2.5Kg）于膝關(guān)節(jié)股骨滑車處建造全層軟骨缺損（直徑5毫米，深度4毫米），將1×106BMMSCs與0.1mL PLGA PEG PLGA混合后移植至軟骨缺損處，對照組移植物為0.1mL PLGA PEG PLGA水凝膠，空白組為軟骨缺損未治療。在移植12周后，大體觀察軟骨缺損修復(fù)效果，并通過HE染色、免疫組化、甲苯安藍染色等評定修復(fù)效果，并對新生軟骨II型膠原及糖胺多糖定量分析，以及檢測其生物力學(xué)性質(zhì)。 結(jié)果： 利用辛酸亞錫作為催化劑，PEG作為大分子引發(fā)劑引發(fā)LA和GA的隨機開環(huán)聚合合成PLGA PEG PLGA三嵌段共聚物，并充分驗證了其化學(xué)結(jié)構(gòu)。聚合物PLGA嵌段的數(shù)均分子量分別為1600gmol-1，880g mol-1，1400g mol-1，1750g mol-1，，LA/GA (mol/mol)均為75:25。四種聚合物的CMC數(shù)據(jù)分別為6.6mg·L-1、4.2mg·L-1、2.0mg·L-1以及1.2mg·L-1。膠束的流體動力學(xué)半徑分別為32.1±6.9nm、76.3±5.45nm、95.6±7.89nm、148.7±10.13nm。4種凝膠（20wt%）磷酸鹽緩沖液（PBS）在低溫（4°C）時為液態(tài)，除聚合物2外，其余3種聚合物PBS溶液在37°C時轉(zhuǎn)變?yōu)槟z。流變學(xué)實驗證實了其較強的機械性能，溫敏水凝膠G′值達到3kPa，凸顯了這種材料作為可注射水凝膠作為軟骨組織工程的潛能。凝膠在體外和體內(nèi)均可降解，但體內(nèi)的降解速率比體外快。噻唑藍實驗72h的細胞存活率90%，具有較好的生物相容性。細胞粘附及增殖實驗檢測細胞在凝膠表面相對粘附率超過50%，在水凝膠內(nèi)部培養(yǎng)21天表現(xiàn)高達數(shù)倍的相對增殖率，證實了所制備的水凝膠具有優(yōu)良的細胞粘附和增殖能力。在混合物移植后12周觀察發(fā)現(xiàn)再生軟骨與周圍正常軟骨及軟骨下骨結(jié)合完好。免疫組織化學(xué)染色和甲苯胺藍染色及生化分析證實了新生軟骨中Ⅱ型膠原和糖胺多糖的沉積。納米壓痕試驗證實了新生軟骨生物力學(xué)性能接近于透明軟骨。 結(jié)論： PLGA PEG PLGA溫敏型水凝膠可以作為一種良好的可注射生物材料應(yīng)用于組織工程等領(lǐng)域，其作為BMMSCs載體可能在臨床上用于促進軟骨缺損的修復(fù)。
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【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R318.08

【參考文獻】

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本文編號：1477092