本文關(guān)鍵詞： 引導(dǎo)骨再生 絲素蛋白 靜電紡絲 骨組織工程　出處：《中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：隨著種植牙技術(shù)的普及及相關(guān)材料學(xué)、再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展,種植牙已成為缺牙修復(fù)的首選方式。然而,重建缺牙區(qū)域的牙槽骨組織,提高種植修復(fù)的長(zhǎng)期成功率和美觀效果,仍然是臨床治療中亟待解決的難題。引導(dǎo)骨再生技術(shù)是解決這一難題最常用、最有效的方法之一,該技術(shù)的關(guān)鍵在于通過(guò)使用屏障膜物理性地阻隔軟組織與骨缺損區(qū)域,給骨缺損區(qū)域創(chuàng)建一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的骨再生空間,保護(hù)生長(zhǎng)且遷移速度較慢的前體成骨細(xì)胞進(jìn)入骨缺損區(qū),達(dá)到缺損區(qū)骨質(zhì)的修復(fù)性再生。膠原膜是一種最為常見(jiàn)的生物屏障膜材料,然而良好的生物相容性并不能彌補(bǔ)其力學(xué)性能低、骨誘導(dǎo)能力不足等缺陷。絲素蛋白作為一種新型的生物醫(yī)用材料,具有良好的生物相容性、優(yōu)異的力學(xué)性能以及可控的降解性和可塑性,已被廣泛用于骨組織工程領(lǐng)域的研究。近年來(lái),鍶作為一種新型的骨誘導(dǎo)元素,被證實(shí)對(duì)骨代謝具有雙向調(diào)節(jié)作用,有利于骨組織的修復(fù)再生。本研究中,我們以絲素蛋白材料為主體,采用靜電紡絲技術(shù)構(gòu)建含鍶元素的仿生絲素蛋白生物膜,系統(tǒng)地對(duì)材料的理化特性進(jìn)行表征,研究材料對(duì)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞粘附、增殖及成骨向分化的影響,并通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證材料用于膜引導(dǎo)骨再生的可行性,為新型引導(dǎo)骨再生生物膜的優(yōu)化及開(kāi)發(fā)提供參考。第一部分 改良絲素蛋白納米纖維膜的制備及其用于修復(fù)大鼠顱骨缺損的效果評(píng)價(jià)目的：研究采用新型酸鹽溶解體系及靜電紡絲技術(shù)制備的改良純絲素蛋白膜的理化特性,并將其用于大鼠顱骨缺損的修復(fù)治療,探討將這種絲素蛋白膜代替引導(dǎo)骨再生膜的可行性。方法：1.本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上,使用新型的溴化鋰-甲酸溶解體系溶解蠶絲,利于靜電紡絲技術(shù)制備絲素蛋白納米纖維膜。2.利于掃描電子纖維鏡觀察材料的形貌特征,紅外光譜儀分析材料的結(jié)構(gòu)成分,萬(wàn)能力學(xué)試驗(yàn)機(jī)測(cè)試材料的力學(xué)性能。3.將絲素蛋白納米纖維膜與Bio-gide(?)膠原膜分別植入大鼠顱骨缺損模型,采用Micro-CT檢測(cè)、HE染色及Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色評(píng)估術(shù)后4周與12周時(shí)的骨缺損修復(fù)情況。結(jié)果：1.絲素蛋白膜由隨機(jī)取向的納米纖維組成,纖維直徑為200-600納米,該絲素蛋白膜的力學(xué)性能要優(yōu)于膠原膜。2.大鼠顱骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：術(shù)后4周時(shí),絲素蛋白膜的引導(dǎo)骨再生效果優(yōu)于膠原膜;術(shù)后12周時(shí),兩組骨修復(fù)均已接近完成。結(jié)論：在本部分實(shí)驗(yàn)中,我們使用靜電紡絲技術(shù)配合新型的蠶絲溶解體系,成功制備了具有良好力學(xué)性能的絲素蛋白納米纖維膜,該膜具有良好的生物相容性、定的骨引導(dǎo)再生能力及與骨再生相適應(yīng)的降解速率,同時(shí)絲素蛋白材料來(lái)源廣泛、價(jià)格適中,可以作為制備引導(dǎo)骨再生膜的潛在替代材料。第二部分 氯化鍶/絲素蛋白納米纖維膜的制備及其用于膜引導(dǎo)骨再生的實(shí)驗(yàn)研究目的：在第一部分實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,嘗試將骨誘導(dǎo)元素鍶引入絲素蛋白納米纖維膜中,制備氯化鍶／絲素蛋白納米纖維膜,表征膜材料的理化性能,研究其對(duì)于大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、分化的影響,通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其用于引導(dǎo)骨再生膜的可行性。方法：1.在對(duì)絲素蛋白溶液進(jìn)行靜電紡絲的過(guò)程中加入氯化鍶溶液,制成氯化鍶/絲素蛋白納米纖維膜。2.掃描電子顯微鏡觀察材料的形貌特征,X射線衍射儀及X射線光電子能譜儀分析材料的結(jié)構(gòu)組成,浸提實(shí)驗(yàn)檢測(cè)材料中鍶離子的釋放曲線。3.體外大鼠全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞分子表型及成骨、成脂向分化鑒定。4.將大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與材料共培養(yǎng),通過(guò)掃描電鏡觀察及CCK-8檢測(cè)細(xì)胞的增殖、粘附情況。5.對(duì)與材料共培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo),通過(guò)堿性磷酸酶活性檢測(cè)細(xì)胞的骨向分化。6.將氯化鍶/絲素蛋白膜材料植入大鼠顱骨缺損模型,并與純絲素膜及空白組作對(duì)照研究,采用Micro-CT檢測(cè)、HE染色及Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色評(píng)估術(shù)后6周時(shí)的骨缺損修復(fù)情況。結(jié)果：1.本實(shí)驗(yàn)制得含氯化鍶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、5%、10%的氯化鍶/絲素蛋白納米纖維膜,膜材料的外觀與純絲素蛋白膜無(wú)明顯差異,納米纖維直徑隨氯化鍶含量的增加而增大,三組材料在早期均有鍶離子的快速釋放。2.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在氯化鍶/絲素蛋白膜表面粘附數(shù)量明顯增多,細(xì)胞增殖活性及堿性磷酸酶活性也高于純絲素蛋白膜組,并且具有一定的濃度依賴性。3.選取10%氯化鍶/絲素蛋白膜用于大鼠顱骨缺損模型的修復(fù)治療,結(jié)果顯示該膜具有更理想的引導(dǎo)骨再生效果。結(jié)論：在本部分實(shí)驗(yàn)中,我們首次制備了氯化鍶/絲素蛋白納米纖維膜,該新型膜材料具有良好的生物相容性,一定的鍶離子緩釋作用,更優(yōu)異的骨誘導(dǎo)再生能力及與骨再生相適應(yīng)的降解速率�；谏鲜鼋Y(jié)果,我們認(rèn)為這種氯化鍶/絲素蛋白納米纖維膜是一種理想的引導(dǎo)骨再生膜替代材料。第三部分 基于生物礦化的碳酸鍶/絲素蛋白納米纖維膜的構(gòu)建及其對(duì)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與分化的影響目的：在第二部分實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,我們以絲素蛋白生物大分子為模板,嘗試通過(guò)生物礦化的方法將氯化鍶/絲素蛋白納米纖維中的氯化鍶轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀偷奶妓徭J,以期改善氯化鍶/絲素蛋白膜早期的“爆釋”現(xiàn)象,獲得碳酸鍶/絲素蛋白納米纖維膜,表征材料的形貌特征、碳酸鍶結(jié)晶形態(tài)及鍶離子的釋放量,并進(jìn)一步分析其對(duì)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及骨向分化的影響。方法：1.在第二部分實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取10%氯化鍶/絲素蛋白納米纖維膜為原料,通過(guò)氣相擴(kuò)散生物礦化的方法制備成碳酸鍶/絲素蛋白納米纖維膜2.掃描電子顯微鏡觀察材料的形貌特征,X射線衍射儀分析材料的組成結(jié)構(gòu),浸提實(shí)驗(yàn)檢測(cè)材料中鍶離子的釋放曲線。3.將大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與材料共培養(yǎng),通過(guò)掃描電鏡觀察及CCK-8檢測(cè)細(xì)胞的增殖、粘附情況。4.對(duì)與材料共培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo),檢測(cè)堿性磷酸酶活性,并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)細(xì)胞成骨向分化相關(guān)基因RUNX2、BSP、OCN的表達(dá)情況。結(jié)果：1.本實(shí)驗(yàn)制得碳酸鍶/絲素蛋白納米纖維膜,膜外觀較礦化前粗糙,平整度稍差。電鏡顯示材料納米纖維表面出現(xiàn)許多納米碳酸鍶顆粒,分布均勻。該材料中鍶離子的釋放量及釋放速率較氯化鍶/絲素蛋白膜明顯降低。2.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在碳酸鍶/絲素蛋白表面能形成良好的早期粘附,并不斷增值,細(xì)胞表面早期即分泌出現(xiàn)顆粒樣細(xì)胞外基質(zhì)。3.相較于純絲素蛋白膜,摻鍶的絲素蛋白膜能明顯促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的堿性磷酸酶活性,同時(shí)上調(diào)成骨向分化基因的表達(dá);并且碳酸鍶/絲素蛋白材料的促成骨向分化作用更為明顯。結(jié)論：在本部分實(shí)驗(yàn)中,我們采用生物礦化的方法成功制成含納米碳酸鍶顆粒的絲素蛋白納米纖維膜,該新型材料具有穩(wěn)定的鍶離子緩釋作用,良好的生物相容性,能更好地促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的粘附增殖及骨向分化。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,我們需要通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究材料的生物學(xué)性能及骨引導(dǎo)性,以滿足骨組織工程的需要。
[Abstract]:A new kind of biological medical material has been used for repairing bone defects in rats . A novel silk fibroin nanofiber membrane with good mechanical properties was prepared by using electrostatic spinning technology to prepare silk fibroin nanofiber membrane with good mechanical properties . The strontium chloride / silk fibroin nanofiber membrane was prepared by the method of biomineralization in order to improve the expression of strontium ions in bone marrow mesenchymal stem cells .

【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R783.1

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