本文關(guān)鍵詞：血管壁局部去交感神經(jīng)對組織工程骨體內(nèi)成骨效果的影響　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：在骨科臨床工作中,多種因素導(dǎo)致的大段骨缺損與骨不連仍舊是困擾骨科醫(yī)生的世界性難題。目前臨床上常用的治療方法有自體骨移植、異體骨移植、人工骨填充等。但由于供區(qū)受限、免疫原性、缺乏生物活性等原因限制了這些方法的臨床應(yīng)用。組織工程骨的出現(xiàn)給這一問題的解決提供了一種可行的方法。而組織工程骨的血管化和神經(jīng)化是組織工程骨實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化的重要技術(shù)難題。因此研究組織工程骨血管化和神經(jīng)化的機(jī)制,尋找血管化和神經(jīng)化的最佳途徑是骨組織工程研究的當(dāng)務(wù)之急。課題組以往研究發(fā)現(xiàn):血管束和感覺神經(jīng)束植入組織工程骨后具有同等促成骨和神經(jīng)化作用。然而實驗中所用的血管束本身含有大量交感神經(jīng)分布于血管外膜支配中膜平滑肌。其促成骨和神經(jīng)化作用是血管本身的作用還是外膜交感神經(jīng)的作用?血管和神經(jīng)在促進(jìn)組織工程骨神經(jīng)化和血管化過程中起著怎樣的協(xié)同作用?它們相互之間是怎樣的關(guān)系?這些仍是未知的科學(xué)問題。為此,本實驗首先嘗試使用顯微外科方法剝除家兔股動脈血管外膜,建立血管壁局部去交感神經(jīng)的模型,然后將局部去交感神經(jīng)血管和正常血管束分別植入組織工程骨,對比觀察其對組織工程骨成骨影響,闡明血管和神經(jīng)在組織工程骨修復(fù)大段骨缺損過程中的作用。第一部分顯微外科技術(shù)構(gòu)建家兔股動脈局部去交感神經(jīng)模型目的研究顯微外科技術(shù)在體內(nèi)去除兔股動脈交感神經(jīng)的可行性,排除血管外膜交感神經(jīng)的影響,為進(jìn)一步研究組織工程骨神經(jīng)化機(jī)制提供可靠的動物實驗?zāi)Ｐ�。方�?1只新西蘭大白兔隨機(jī)分4組:對照組(n=3)、4周組(n=6)、8周組(n=6)、12周組(n=6)。分離21只新西蘭大白兔雙側(cè)股動脈,實驗組在手術(shù)顯微鏡放大10倍視野下于股動脈中段剝除血管外膜;對照組僅做血管顯露。于術(shù)后4周、8周、12周分別取材行蘇木精·伊紅(he)染色觀察血管壁結(jié)構(gòu)、乙醛酸熒光染色觀察交感神經(jīng)分布及其熒光強(qiáng)度、westernblot檢測交感神經(jīng)特異性蛋白酪氨酸羥化酶(th)的含量。結(jié)果he染色的結(jié)果:3個實驗組動脈外膜層缺失或明顯變薄,平滑肌層和內(nèi)膜無明顯增厚或者變薄,對照組動脈血管各層結(jié)構(gòu)完整。乙醛酸染色結(jié)果:對照組、4周組、8周組、12周組的熒光強(qiáng)度a值分別為:0.08124±0.00260、0.02920±0.00206、0.02661±0.00233、0.03094±0.00211,n=6各實驗組與對照組相比熒光分布范圍明顯縮小,熒光強(qiáng)度顯著減弱,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),各實驗組之間的熒光強(qiáng)度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)westernblot結(jié)果:對照組、4周組、8周組、12周組wb條帶半定量分析值分別為:0.8626±0.03519、0.3631±0.03019、0.3964±0.02239、0.3487±0.02356,n=6各實驗組與對照組相比,th的含量均明顯減少,結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05);而3個實驗組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論顯微外科手術(shù)剝除法可有效去除動脈血管外膜的交感神經(jīng)。該方法作用持久,交感神經(jīng)去除徹底且在4周、8周、12周3個觀察點(diǎn)內(nèi)無論從神經(jīng)遞質(zhì)方面還是特異性蛋白方面都沒有觀察到交感神經(jīng)的明顯再生,故該方法可為研究單純血管因素對組織工程骨的影響提供持久、有效、可靠的動物模型。目的將種子細(xì)胞bmsc與β—tcp多孔生物陶瓷支架材料復(fù)合培養(yǎng),使種子細(xì)胞bmsc能夠在支架材料上成活和生長,確保體內(nèi)實驗的順利進(jìn)行。方法取胎兔原代bmsc,培養(yǎng)至p3代,以107/ml的密度接種于β—tcp多孔生物陶瓷支架材料上,材料為長方體,高15mm,底面為4mmx4mm的正方形。以負(fù)壓吸引法排除材料內(nèi)的氣體,使細(xì)胞懸液充分進(jìn)入材料,隨后放入培養(yǎng)皿中復(fù)合培樣。復(fù)合培養(yǎng)5天后用戊二醛固定樣本,于掃描電鏡下觀察bmsc的貼附和生長狀態(tài)。結(jié)果36小時后觀察可見bmsc貼壁生長,呈長梭形,但仍有大量未貼壁的雜質(zhì)細(xì)胞。傳代后胎兔bmsc生長狀態(tài)良好,貼壁生長呈長梭形或漩渦狀,雜質(zhì)細(xì)胞逐漸減少。bmsc與β—tcp多孔生物陶瓷支架材料復(fù)合培養(yǎng)5天后,掃描電鏡下觀察種子細(xì)胞bmsc在材料上貼附和生長狀況。電鏡下可見β—tcp表面bmsc細(xì)胞附著,細(xì)胞排列緊密并且生長狀態(tài)良好。結(jié)論bmsc可以貼附在β—tcp多孔生物陶瓷支架材料上,并且生長狀態(tài)良好,因此可用于下一步體內(nèi)植入實驗。第三部分血管壁局部去交感神經(jīng)對組織工程骨體內(nèi)成骨效果的影響目的研究血管壁局部去交感神經(jīng)對組織工程骨體內(nèi)成骨效果的影響,進(jìn)一步探究組織工程骨血管化、神經(jīng)化與三者之間的關(guān)系。方法10只新西蘭大白兔隨機(jī)分為3組。于10只新西蘭大白兔右橈骨構(gòu)建1.5cm臨界骨缺損。實驗組8只:正常血管束植入組4只(組織工程骨+正常血管束),去血管外膜組(組織工程骨+局部去外膜血管束),對照組2只(僅植入組織工程骨),組間做好標(biāo)記。術(shù)后12周取材,行大體觀察、x線片、顯微ct、四環(huán)素鈣黃綠素?zé)晒怆p標(biāo)、vg染色等處理。檢測組織工程骨體內(nèi)成骨的效果。結(jié)果大體觀察:血管移植組和去血管外膜組骨缺損斷端已經(jīng)愈合,組織工程骨支架材料在缺損部位的表面不可見;而對照組中組織工程骨支架材料仍舊清晰可見,骨缺損的斷端愈合情況較差。x線片:與對照組相比血管移植組和去血管外膜組x線片中的材料影已經(jīng)變得模糊不清甚至可以觀察到骨髓腔的再通,但血管移植組和去血管外膜組之間并沒有觀察到肉眼可見的差異;對照組β-tcp材料陰影仍舊明顯,可輕易辨認(rèn)出材料的輪廓。顯微ct:1.標(biāo)本三維重建:血管移植組和去血管外膜組紅色的成骨區(qū)域要遠(yuǎn)大于對照組的紅色成骨區(qū)域;而血管移植組和去血管外膜組藍(lán)色材料殘留的區(qū)域要明顯小于對照組材料的殘余量。去血管外膜組和正常血管組無肉眼可見的差別。2.三組材料的新生骨體積分?jǐn)?shù)BVF:血管移植組和去血管外膜組與對照組相比成骨量明顯增多,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),但是血管移植組和去血管外膜組成骨量之間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。3.三組材料剩余體積比例:血管移植組和去血管外膜組與對照組相比材料殘余量明顯減少差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),但是血管移植組和去血管外膜組材料的殘余量之間的差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。四環(huán)素和鈣黃綠素?zé)晒怆p標(biāo)實驗:礦物沉積率MAR:血管移植組和去血管外膜組比對照組礦物沉積率MAR明顯增高差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),但血管移植組和去血管外膜組材料的礦物沉積率MAR之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異。VG染色:與對照組相比血管移植組和去血管外膜組紅色成骨區(qū)域的面積要明顯大于對照組的成骨區(qū)域面積。且血管外膜移植組和去血管外膜組沒有肉眼可見的明顯差異。結(jié)論去交感神經(jīng)血管束和正常血管束植入組織工程骨內(nèi)12周與單純組織工程骨相比均具有顯著促進(jìn)組織工程骨體內(nèi)成骨的作用,且兩者促成骨作用無統(tǒng)計學(xué)差異。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R318.08;R68

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