本文關(guān)鍵詞：角蛋白聚乙烯醇復(fù)合神經(jīng)支架的構(gòu)建及其細(xì)胞相容性的研究

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【摘要】：神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的再生與修復(fù)是神經(jīng)組織工程中倍受關(guān)注的問題。相比于直接修復(fù)、自體/異體神經(jīng)移植等治療方法,神經(jīng)支架為解決神經(jīng)來源有限、移植成功率低、排斥反應(yīng)嚴(yán)重和修復(fù)范圍不廣等難題帶來了新希望。作為神經(jīng)組織工程的應(yīng)用主體,神經(jīng)支架為神經(jīng)再生與修復(fù)提供了最佳的生物微環(huán)境,支持細(xì)胞粘附增殖,引導(dǎo)細(xì)胞分化遷移,減輕細(xì)胞炎癥反應(yīng),達(dá)到促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生與神經(jīng)組織修復(fù)的目的。角蛋白是具有臨床應(yīng)用前景的功能型神經(jīng)支架材料,它來源天然取材豐富、免疫原性低、降解吸收性好。但角蛋白粘度低極性小、成紡性較差,這使得制備單一角蛋白支架十分困難。前期研究中,已有學(xué)者將多種生物材料與角蛋白混合共紡納米纖維用于組織工程,但角蛋白與其他材料混紡會影響纖維的力學(xué)性能,并且混紡的復(fù)合納米纖維表面不能保證角蛋白覆蓋,這也影響了角蛋白混合纖維的生物性能�；诖�,本課題使用靜電紡絲技術(shù)制備了表面負(fù)載角蛋白納米顆粒的聚乙烯醇(Polyvinyl Alcohol,PVA)復(fù)合纖維支架(Keratose Nanoparticles-coated-PVA fibers,KosNPs/PVA)用于神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng),角蛋白/PVA混合纖維支架(KOS/PVA composite fibers,KOS/PVA)在本研究中也進(jìn)行制備作為對照。KosNPs/PVA支架由PVA纖維作為骨架,并且表面附著角蛋白納米顆粒,與KOS/PVA納米纖維相比更具有增強(qiáng)細(xì)胞相容性的潛力。主要研究內(nèi)容和結(jié)論:1.采用氧化法提取人發(fā)角蛋白,對氧化型角蛋白(Keratose,KOS)進(jìn)行提取率、蛋白定性和氨基酸定量分析。(1)用該法成功提取KOS,SDS-PAGE電泳圖顯示蛋白分子量約為40kDa,與文獻(xiàn)報道一致;(2)被檢測出的氨基酸共17種,絲氨酸,谷氨酸和蘇氨酸含量相對較高;(3)氨基酸含量穩(wěn)定在50%以上。說明氧化劑過氧乙酸選取合適,提取的蛋白可用于復(fù)合支架的制備。2.利用靜電紡絲技術(shù)制備角蛋白復(fù)合支架,對微觀結(jié)構(gòu)形態(tài)及生物學(xué)性能進(jìn)行考察。(1)按照一定配比(KOS:PVA=1:2.5,1:5,1:7.5,1:10),成功制備KosNPs/PVA和KOS/PVA;(2)SEM表征結(jié)果發(fā)現(xiàn):KosNPs/PVA中的角蛋白納米顆粒呈球形附著于纖維上,形成了納米顆粒附著纖維的微觀結(jié)構(gòu),底層纖維相互交疊,因而支架具有高度聯(lián)通的多孔結(jié)構(gòu)。同時,KOS/PVA也具有典型的纖維結(jié)構(gòu)。(3)FTIR和XRD測試結(jié)果發(fā)現(xiàn):通過靜電紡絲技術(shù)制備兩種不同結(jié)構(gòu)復(fù)合神經(jīng)支架對KOS和PVA的化學(xué)結(jié)構(gòu)與晶型沒有明顯影響;(4)水接觸角結(jié)果發(fā)現(xiàn),復(fù)合支架具有強(qiáng)親水性,且隨著角蛋白含量的增加而親水性顯著增加。KosNPs/PVA 1:10 1:7.5 1:51:2.5組的接觸角分別為25.1±1.8o,23.2±1.3o,17.1±1.9o,15.7±2.0o,說明角蛋白表面親水的酰胺基側(cè)鏈和絲氨酸存在,增加了支架的親水性,且納米顆粒附著纖維的微觀結(jié)構(gòu)對其親水性的增加沒有顯著影響;(5)力學(xué)性能結(jié)果發(fā)現(xiàn),各組KosNPs/PVA的力學(xué)性能沒有明顯差異,與純PVA纖維支架的力學(xué)性能接近,說明納米粒附著纖維的微觀結(jié)構(gòu)沒有影響纖維的力學(xué)性能。但KOS/PVA復(fù)合支架的拉伸強(qiáng)度和楊氏模量與KosNPs/PVA相比較高。3.綜合上述表征結(jié)果,本研究選取KosNPs/PVA 1:7.5,1:5組作為實(shí)驗(yàn)組,KOS/PVA 1:7.5,1:5組作為對照組,考察不同類型角蛋白復(fù)合支架的細(xì)胞相容性。分別選用大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞和大鼠C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞模擬神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育模型,考察細(xì)胞粘附、生長增殖情況以及NCAM、GAP-43、MAP-2、GFAP基因的表達(dá)。(1)細(xì)胞形態(tài)結(jié)果表明,兩種角蛋白復(fù)合支架能很好的支持細(xì)胞生長,但PC12細(xì)胞和C6細(xì)胞在KosNPs/PVA上顯示出更好的生長活力,說明纖維表面角蛋白納米顆粒的附著可促進(jìn)細(xì)胞生長;(2)粘附結(jié)果表明,PC12細(xì)胞粘附力依次是KOS/PVA組KosNPs/PVA組PVA組,C6細(xì)胞是KosNPs/PVA組KOS/PVA組PVA組,說明角蛋白在纖維表面的包覆有助于細(xì)胞的粘附,但C6細(xì)胞對角蛋白的響應(yīng)更敏感;(3)增殖結(jié)果表明,0-24h內(nèi),各組支架培養(yǎng)的PC12、C6細(xì)胞增殖活力沒有明顯差異。24-48h內(nèi),KosNPs/PVA組支架上的細(xì)胞增殖活力加強(qiáng),細(xì)胞數(shù)量增多。說明纖維表面的角蛋白有營養(yǎng)、支持細(xì)胞生長的作用。(4)基因表達(dá)結(jié)果表明,與KOS/PVA相比,KosNPs/PVA復(fù)合支架可以上調(diào)PC12細(xì)胞的NCAM、GAP-43、MAP-2的表達(dá),能增強(qiáng)細(xì)胞與支架材料的粘附,促進(jìn)微管結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定,有利于細(xì)胞的生長發(fā)育。KosNPs/PVA組的C6細(xì)胞NCAM、GAP-43基因表達(dá)也呈上調(diào)趨勢,說明KosNPs/PVA與KOS/PVA相比對細(xì)胞具有更優(yōu)的支持和穩(wěn)定生長的作用。
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R318.08

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本文編號：1306668