本文關(guān)鍵詞：血紅素氧化酶1對脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、凋亡、成骨活性和募集能力的影響

  更多相關(guān)文章： 血紅素氧化酶1 脂肪基質(zhì)干細(xì)胞 慢病毒 增殖 凋亡 成骨分化 募集

【摘要】：目的:從大鼠腹股溝脂肪中提取培養(yǎng)脂肪基質(zhì)干細(xì)胞(Adipose-derived stromal cells,ADSCs),鑒定其生物學(xué)特性;構(gòu)建高表達(dá)血紅素氧化酶1(Heme oxygenase1,HO-1)的慢病毒表達(dá)載體,包裝病毒后轉(zhuǎn)染ADSCs,建立ADSCs-HO-1模型;體外研究HO-1修飾的ADSCs對其自身增值、凋亡和成骨分化的影響,以及對周圍細(xì)胞的募集作用,并探討其在骨組織工程中的應(yīng)用策略。方法:1.膠原酶消化脂肪獲取細(xì)胞后,采用密度梯度離心聯(lián)合貼壁篩選法分離培養(yǎng)ADSCs,接種于培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)傳代。通過觀測其形態(tài)特點(diǎn)、流式細(xì)胞技術(shù)鑒定其表面標(biāo)志和多功能分化潛能(成脂分化和成骨分化)鑒定培養(yǎng)細(xì)胞為脂肪基質(zhì)干細(xì)胞;2.從攜帶有目的基因HO-1的載體Puc57上克隆目的基因序列,通過酶切、酶連,將其連入慢病毒表達(dá)載體p Zs G中,再將連接成功的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α,經(jīng)菌落PCR鑒定連接結(jié)果,擴(kuò)增提取該表達(dá)載體。將攜帶目的基因的慢病毒表達(dá)載體與另外三個慢病毒包裝載體在293T細(xì)胞中包裝,分別于48h和72h收集慢病毒液。在8μg/ml的轉(zhuǎn)染試劑Polybrene條件下轉(zhuǎn)染ADSCs,建立ADSCs-HO-1模型,western blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染結(jié)果;3.將細(xì)胞分為四組:ADSCs轉(zhuǎn)導(dǎo)HO-1組(A組)、ADSCs轉(zhuǎn)導(dǎo)空載體組(B組)、ADSCs未轉(zhuǎn)導(dǎo)組(C組)和ADSCs轉(zhuǎn)導(dǎo)HO-1組加錫-原卟啉(Sn-protoporphyrin,Sn PP)(D組)。采用MTT、流式細(xì)胞儀分析凋亡率探討HO-1修飾的ADSCs對其自身增值、凋亡和成骨分化的影響;通過q RT-PCR檢測骨標(biāo)志物和鈣基質(zhì)染色分析HO-1修飾的ADSCs對其自身成骨分化情況;劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell觀察HO-1高表達(dá)對ADSCs募集作用的影響。結(jié)果:1.體外成功分離培養(yǎng)出大鼠ADSCs,形態(tài)呈長梭形,具有成骨、成脂分化潛能,經(jīng)鑒定第2代貼壁細(xì)胞陽性表達(dá)CD29(99.3%)、CD44(70.7%)、CD90(52.0%),陰性表達(dá)CD45(3.73%)和CD31(6.58%);2.構(gòu)建高表達(dá)HO-1的慢病毒表達(dá)載體p Zs G-HO-1,菌落PCR證實(shí)HO-1片段連入表達(dá)載體,包裝慢病毒后轉(zhuǎn)染ADSCs,western blot檢測HO-1蛋白在ADSCs中高表達(dá);3.①M(fèi)TT連續(xù)1周檢測A和B組細(xì)胞活性,第2天測定A組較B組活性增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)且持續(xù)一周;②流式分析細(xì)胞凋亡率顯示,A組細(xì)胞凋亡率為41.3%±3.34%,較B組(58.7%±4.25%)和C組(55.3%±4.50%)明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),且Sn PP可增加A組細(xì)胞的凋亡率(70.7%±4.01%);③q RT-PCR測得細(xì)胞成骨分化第7天時,ALP和Runx2升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),ColⅠ和OCN未見明顯差異;第14天時,ALP、Runx2、ColⅠ和OCN均較第7天升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05);第21天時,茜素紅和von kossa均證實(shí),HO-1高表達(dá)可提高ADSCs鈣結(jié)節(jié)形成。④劃痕實(shí)驗(yàn)顯示A組細(xì)胞遷移率69.3%±3.8%,較B組(31.5%±8.4%)和C組(32.8%±8.6%)明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05);transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí),A組上清可增加細(xì)胞遷移的數(shù)量,且這種效應(yīng)可被HO-1活性抑制劑Sn PP抑制。結(jié)論:1.密度梯度離心聯(lián)合貼壁方法簡單、可以大量體外擴(kuò)增ADSCs,具有多向分化潛能,表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物,無內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞混雜。2.成功構(gòu)建高表達(dá)HO-1的慢病毒表達(dá)載體和ADSCs-HO-1模型。3.HO-1高表達(dá)在無HO-1活性抑制劑存在的前提下,可提高ADSCs增殖活性、抗凋亡能力、促進(jìn)ADSCs成骨分化和提高ADSCs募集能力。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R687;R318.08

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王運(yùn)濤;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化調(diào)控的研究進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué)(生物醫(yī)學(xué)工程分冊);2003年01期

2 井燕;李良;李毅;陳孟詩;吳文超;陳槐卿;劉小菁;;力學(xué)應(yīng)變對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨分化能力的影響[J];生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志;2006年03期

3 崔向榮;蘇偉;黃釗;覃萬安;;電磁場促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的研究進(jìn)展[J];中國醫(yī)學(xué)物理學(xué)雜志;2011年04期

4 彭飛;鄭亞東;徐西強(qiáng);虞冀哲;吳華;;620nm低能量紅光對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響[J];激光生物學(xué)報;2011年03期

5 趙領(lǐng)洲;劉麗;吳織芬;;微米坑/納米管氧化鈦形貌對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用[J];醫(yī)學(xué)爭鳴;2012年04期

6 楊姣;夏雷;湯郁;陸化;費(fèi)小明;;腫瘤壞死因子預(yù)處理促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化潛能[J];南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2014年03期

7 王晶;張洹;;-80℃一步法凍存對成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力的影響[J];廣東醫(yī)學(xué);2007年03期

8 陳翠平;羅新;;17β-雌二醇對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用[J];中國骨質(zhì)疏松雜志;2007年05期

9 ;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2010年10期

10 吳玉瓊;房兵;江凌勇;;間歇牽拉應(yīng)變對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與成骨分化的影響[J];醫(yī)用生物力學(xué);2011年06期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 鄭亮;鄭雅元;崔燎;劉鈺瑜;;四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用及機(jī)制研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第七次全國骨質(zhì)疏松和骨礦鹽疾病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2013年

2 吳江;陳槐卿;K-LP.SUNG;;鈦顆粒負(fù)荷影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力的機(jī)理[A];全國首屆青年復(fù)合材料學(xué)術(shù)交流會論文集[C];2007年

3 吳江;陳槐卿;李良;尹光福;K-L P．SUNG;;鈦顆粒負(fù)荷影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力的機(jī)理[A];中國復(fù)合材料學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2005年

4 陳海嘯;洪盾;萬曉晨;李繼承;;腸毒素C聯(lián)合維生素C對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響研究[A];2008年浙江省骨科學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2008年

5 袁風(fēng)紅;鄒耀紅;高愷言;俞可佳;;地塞米松對體外人骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖及成骨分化的影響[A];全國自身免疫性疾病專題研討會暨第十一次全國風(fēng)濕病學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2006年

6 宋忠臣;束蓉;董家辰;李松;;低氧對牙周膜成纖維細(xì)胞增殖和成骨分化的影響[A];第十次全國牙周病學(xué)學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2014年

7 董家辰;束蓉;宋忠臣;;炎癥微環(huán)境對人牙周膜成纖維細(xì)胞增殖與成骨分化的影響[A];第十次全國牙周病學(xué)學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2014年

8 孫楠;楊力;張振;張樺;陳宏;蔡德鴻;;晚期氧化蛋白產(chǎn)物對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及向成骨分化的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會第十二次全國內(nèi)分泌學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2013年

9 馬雪;孟靜茹;賈敏;王寧;胡靜;周穎;羅曉星;;胰高血糖素樣肽-1類似物對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與成骨分化的影響[A];第十一屆全國青年藥學(xué)工作者最新科研成果交流會論文集[C];2012年

10 林和敏;;成骨分化的人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞免疫原性研究[A];2013年全國激光醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)聯(lián)合會議暨2013年浙江省醫(yī)學(xué)會整形美容學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2013年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 龔逸明;microRNAs調(diào)控Satb2介導(dǎo)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

2 李松濤;EphB信號在軸向仿生壓應(yīng)力調(diào)控MSC成骨分化中的作用和機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

3 方文;純鈦表面WNT信號通路調(diào)控BMSCs成骨分化的機(jī)制研究[D];浙江大學(xué);2014年

4 劉世宇;移植外源性MSCs持久恢復(fù)宿主MSCs功能的機(jī)制研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2015年

5 張莉;Fgfr2~(S252W/+)小鼠骨量、骨結(jié)構(gòu)特性及BMSCs成骨分化調(diào)控機(jī)制的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

6 楊勇;電磁場促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化及初步機(jī)制[D];華中科技大學(xué);2010年

7 王琪;雌激素受體-α在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)及對成骨分化影響的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2007年

8 湯郁;SLE患者骨髓MSC成骨分化機(jī)制研究[D];南京中醫(yī)藥大學(xué);2011年

9 江n;低強(qiáng)度脈沖超聲波對大鼠脂肪干細(xì)胞增殖和成骨分化的影響及成骨機(jī)制的初步研究[D];華中科技大學(xué);2012年

10 張麗俠;替諾福韋酯對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響及其機(jī)制探討[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 吳小瑩;腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對人脂肪干細(xì)胞增殖與成骨分化的作用[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2015年

2 秦子順;淫羊藿苷對人牙周膜干細(xì)胞的增殖和成骨分化的影響[D];蘭州大學(xué);2015年

3 劉可;miR-106bE靶向調(diào)控BMP2參與間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化與體內(nèi)骨形成[D];蘇州大學(xué);2015年

4 付雪杰;MSCs與去分化MSCs在成骨分化過程中免疫原性上調(diào)的研究[D];蘇州大學(xué);2015年

5 崔陽陽;蛋白激酶C在小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的作用研究[D];新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院;2015年

6 嚴(yán)一杰;體外誘導(dǎo)人腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞成骨分化的實(shí)驗(yàn)研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2015年

7 高羽萱;直流微電場對種植體周骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移和成骨影響的研究[D];中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2015年

8 郭中豪;甲狀旁腺激素對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響[D];山西醫(yī)科大學(xué);2015年

9 李慧垠;高脂環(huán)境下大鼠BMSCs成骨分化過程中Wnt通路相關(guān)因子的表達(dá)變化[D];山東大學(xué);2015年

10 聶曉萌;MicroRNA靶向Id1對BMSCs成骨分化的影響[D];山東大學(xué);2015年

，

本文編號：1289946