本文關(guān)鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合小腸粘膜下基質(zhì)重建陰道的可行性研究

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【摘要】：第一部分：小腸黏膜下基質(zhì)及靜電紡絲絲素蛋白材料與大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相容性比較 目的：對小腸黏膜下基質(zhì)（small intestinal submucosa, SIS）和靜電紡絲絲素蛋白支架（electrospun silk fibroin scaffold, ESFS）與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells, MSCs）的相容性進行比較，以選擇陰道重建的合適材料。 方法：用全骨髓貼壁法進行大鼠骨髓MSCs培養(yǎng)。用流式細(xì)胞技術(shù)（FCM）檢測第3代MSCs的CD29、CD90和CD45表達(dá)。用成骨和成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液對第3代MSCs進行誘導(dǎo)，并用茜素紅或油紅O檢測誘導(dǎo)情況。將第3代MSCs分別與SIS及ESFS支架復(fù)合培養(yǎng)，細(xì)胞計數(shù)檢測細(xì)胞黏附率，MTT法檢測支架細(xì)胞毒性。用BrdU標(biāo)記第3代MSCs并行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，細(xì)胞計數(shù)法進行標(biāo)記率測定。第3代MSCs分別與兩種支架復(fù)合培養(yǎng)7天后，應(yīng)用掃描電子顯微鏡觀察MSCs在兩種支架上的形態(tài)。將MSCs支架復(fù)合物和單純支架分別埋植于大鼠背部皮下，移植后2、4周取材，用HE染色、Masson三色染色以及免疫組化法觀察支架降解、組織再生情況并檢測MSCs在組織中的定植。 結(jié)果：利用全骨髓貼壁法培養(yǎng)的MSCs具有成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，80%融合時形成漩渦狀結(jié)構(gòu)。流式細(xì)胞術(shù)檢測第3代細(xì)胞CD29、CD90、CD45的表達(dá)率分別為99.91%、99.95%、0.03%。成骨誘導(dǎo)的MSCs茜素紅染色陽性，成脂誘導(dǎo)的MSCs油紅O染色陽性，MSCs能夠成功分化為成骨和脂肪細(xì)胞。第3代MSCs在SIS及ESFS中的黏附率分別為SIS組：90.75%2.12%；ESFS組:89.13%3.36%，SIS組高于ESFS組，但兩者間無明顯差異（P0.05）。兩種支架材料大體觀可見SIS為透明薄膜狀，柔軟，質(zhì)韌，而ESFS白色不透明，質(zhì)地較SIS脆而硬。掃描電鏡觀察兩種支架發(fā)現(xiàn)SIS表面形態(tài)光滑致密，而ESFS由粗細(xì)不等的纖維結(jié)構(gòu)形成立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。MSCs在SIS上的形態(tài)多為長梭形，而在ESFS支架上更加扁平，兩種支架上的MSCs細(xì)胞膜表面均可見分泌顆粒和微絨毛結(jié)構(gòu)，MSCs在SIS和ESFS上生長的平均相對增殖率分別為88.35%和85.48%，兩者與對照組比較有明顯差異（P0.05），但兩者間無明顯差異（P0.05）。兩種支架的毒性等級為Ⅰ級。BrdU標(biāo)記MSCs的標(biāo)記率為81.3%。大鼠皮下移植后4周，在MSCs復(fù)合支架表面新生血管多于單純支架組。HE染色發(fā)現(xiàn)SIS降解速度快于ESFS支架。第2、4周復(fù)合MSCs支架內(nèi)部遷移進入的細(xì)胞多于單純支架組，第4周MSCs復(fù)合支架組血管多于單純支架組。Masson染色可見SIS材料為亮綠色，而ESFS為紅色纖維結(jié)構(gòu)。免疫組化可見有陽性標(biāo)記的MSCs進入周圍組織中。 結(jié)論：SIS和ESFS具有良好的細(xì)胞相容性，可作為負(fù)載MSCs的支架材料，而SIS更柔韌，降解速度更快，能夠更好的與組織貼合以及被新生組織替代。MSCs具有促進新生血管形成的作用。SIS可以作為陰道重建支架材料復(fù)合MSCs進行陰道重建研究。 第二部分：大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合小腸黏膜下基質(zhì)重建大鼠陰道的研究 目的：研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞在陰道重建中的作用，為陰道重建尋找新的方法。 方法：切除成年雌性大鼠陰道組織，分別將單純SIS支架、BrdU標(biāo)記的MSCs復(fù)合SIS支架植入陰道切除后形成的腔穴內(nèi)，上端與宮頸外側(cè)相連，下端與陰道外口切緣縫合。在植入后20天和30天取出重建的陰道組織，行HE染色、Masson染色和免疫組化檢測觀察新生陰道的特點，比較兩種方法重建陰道的效果。 結(jié)果：復(fù)合MSCs的SIS支架組和單純SIS支架組均形成了新生陰道，，并具有一定的彈性。HE染色和Masson染色可見陰道上皮由陰道外口向上逆行生長，最終鋪滿整段陰道腔。在復(fù)合MSCs的SIS支架組，陰道上皮生長較單純支架組更快，間質(zhì)內(nèi)新生血管更多。免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)BrdU標(biāo)記的細(xì)胞存在于新生陰道上皮、新生血管壁以及肌肉組織，并具有相應(yīng)的細(xì)胞形態(tài)。在未形成完整陰道上皮層的陰道腔面，BrdU標(biāo)記的細(xì)胞不具有規(guī)則的陰道上皮結(jié)構(gòu)。 結(jié)論：MSCs能夠促進陰道上皮再生和新生血管形成。MSCs能夠向陰道上皮、血管內(nèi)皮樣細(xì)胞、肌細(xì)胞形態(tài)分化，MSCs向陰道上皮樣細(xì)胞分化可能需要與陰道上皮的直接接觸。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R318.0

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本文編號：1288613