本文關(guān)鍵詞：負(fù)載TGF-β3、BMP-2緩釋微球的DBM誘導(dǎo)滇南小耳豬BMSCs向軟骨分化的研究

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【摘要】：[目的]找到滇南小耳豬骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow stromal cells, BMSCs)高效擴增的方法,以更好地獲取軟骨組織工程種子細(xì)胞；探討TGF-β3(Transforming growth factors, type beta3)和BMP-2(Bone morphogenetic protein-2)聯(lián)合體外誘導(dǎo)滇南小耳豬BMSCs向軟骨分化的作用。 [方法](1)用骨穿針于髂后上棘抽取滇南小耳豬骨髓,采用離心加貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)BMSCs并鑒定。流式細(xì)胞儀檢測第二代BMSCs的表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD45。并取第二代BMSCs作成骨和成軟骨誘導(dǎo),用茜蘇紅染色法檢測成骨方向分化的能力,甲苯胺藍染色檢測成軟骨分化的能力。 (2)取第二代滇南小耳豬BMSCs,于體外用不同生長因子不同分為4組：A組(實驗組)：培養(yǎng)液中加入TGF-β3和BMP-2; B組(實驗對照組)：培養(yǎng)液中加入TGF-β3; C組(實驗對照組)：培養(yǎng)液中加入BMP-2; D組(實驗空白對照組)：培養(yǎng)液中不加入任何生長因子；2天換液1次,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化并用MTT法測定各組的生長增殖曲線。誘導(dǎo)14、21天后細(xì)胞通過軟骨特征性染色,即Ⅱ型膠原免疫組化學(xué)染色測定BMSCs Ⅱ型膠原表達情況,第21天行Western blot檢測BMSCs Ⅱ型膠原蛋白表達情況。結(jié)果數(shù)據(jù)輸入SPSS17.0軟件進行處理,采用單因素方差分析行統(tǒng)計學(xué)處理,以a=0.05為檢驗水準(zhǔn),P0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。 [結(jié)果](1)BMSCs細(xì)胞形態(tài)均為梭形生長,呈成纖維細(xì)胞樣形態(tài)。 (2)流式細(xì)胞檢測P2CD29陽性率為99.41%,P2CD44陽性率為99.52%,P2CD45陰性率為99.93%。 (3)BMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)2周、3周后茜蘇紅染色均為陽性。(4)BMSCs經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)3周后甲苯胺藍染色為陽性；(5)加入細(xì)胞因子的實驗組及實驗對照組在14、21天軟骨特異性Ⅱ型膠原檢測中均有不同程度的陽性表達,空白對照組D組未見陽性表達,Ⅱ型膠原免疫組化灰度值實驗組較實驗對照組和空白對照組表達量高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。21天行Western blot檢測示Ⅱ型膠原蛋白灰度值實驗組較實驗對照組和空白對照組表達量高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 [結(jié)論](1)采用離心加貼壁法培養(yǎng)滇南小耳豬BMSCs是一種高效擴增的方法; (2)第二代滇南小耳豬BMSCs純度高,有多分化潛能,且能向軟骨分化； (3)TGF-β3、BMP-2聯(lián)合誘導(dǎo)更能促進BMSCs向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化,并能促進Ⅱ型膠原的表達,TGF-P3和BMP-2可作為細(xì)胞因子更好地誘導(dǎo)BMSCs向軟骨分化。 [目的]探索制備負(fù)載TGF-β3和BMP-2緩釋微球的脫鈣骨基質(zhì)(Demineralized bone matrix,DBM)支架材料并探索其體外誘導(dǎo)BMSCs成軟骨作用,為軟骨缺損修復(fù)支架材料提供實驗依據(jù)。 [方法](1)根據(jù)Urist描述的方法制得DBM,掃描電鏡觀察DBM的超微結(jié)構(gòu)。采用乳化交聯(lián)法制備TGF-β3、BMP-2殼聚糖微球并應(yīng)用掃描電鏡、image軟件檢測微球形態(tài),ELISA夾心法測定微球載藥量、包封率及體外藥物緩釋率。取制備好的TGF-β3、BMP-2殼聚糖微球與第二代BMSCs體外復(fù)合培養(yǎng),培養(yǎng)21天后,提取細(xì)胞行Ⅱ型膠原免疫組化學(xué)染色和Western blot測定Ⅱ型膠原表達情況。 (2)采用超聲波法將負(fù)載TGF-β3和BMP-2殼聚糖微球與DBM支架復(fù)合,將第二代滇南小耳豬BMSCs置于復(fù)合支架中立體培養(yǎng)。MTT法測定BMSCs在復(fù)合支架上生長增殖曲線。根據(jù)支架材料負(fù)載因子不同分為分為3組：A組(實驗組)：雙因子微球/DBM復(fù)合支架組；B組(實驗對照組)：空白微球/DBM支架組；C組(空白對照組)：單純DBM組；2天換液1次,體外復(fù)合培養(yǎng)3周取材,并制石蠟切片行HE染色,阿利新藍染色、Ⅱ型膠原免疫組化組織學(xué)觀察。 [結(jié)果](1)DBM支架材料外觀均呈白色海綿狀,SEM觀察DBM具有三維天然網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)； (2)殼聚糖緩釋微球平均粒徑53.38μm,球形良好,球體均勻表面光滑,具有較高的包封率,TGF-β3和BMP-2分別為58.7%、53.2%,載藥量分別為22.01ng/mg.17.55ng/mg,藥物釋放試驗表明TGF-β3和BMP-2可以從微球中緩慢釋放,第7天累積釋放量達61%、57.5%; (3)以超聲震蕩法灌注微球進入DBM,微球能均勻地分布于DBM內(nèi)且BMSCs能在復(fù)合支架上附著生長并增殖; (4)負(fù)載雙因子微球和BMSCs復(fù)合培養(yǎng)21天后免疫組化和Western blot檢測Ⅱ型膠原均為陽性； (5)復(fù)合培養(yǎng)3周后,取出型組織學(xué)切片觀察：HE染色見核染色呈藍色,可見軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞增生；阿利新藍染色見支架周圍基質(zhì)染為藍色;Ⅱ型膠原免疫組化見細(xì)胞包漿和基質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒,染色陽性。對照組染色均為陰性或弱陽性。 [結(jié)論](1)DBM具有三維天然網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和良好的細(xì)胞相容性,BMSCs在復(fù)合支架上復(fù)合培養(yǎng)8天時達到峰值； (2)乳化交聯(lián)法制備殼聚糖微球,工藝簡單,重復(fù)性良好,粒徑分布均勻,具有良好的緩釋性能； (3)將BMSCs復(fù)合微球/DBM支架材料能誘導(dǎo)BMSCs向軟骨分化,可應(yīng)用與軟骨組織工程支架材料。
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R318.08

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本文編號：1283439