本文關(guān)鍵詞：適于肝細(xì)胞培養(yǎng)的PEG-肝素水凝膠的研制

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【摘要】：肝臟具有代謝、解毒、合成等功能,是體內(nèi)不可缺少的重要器官。對于末期肝纖維化、肝癌及各種急慢性肝衰竭患者,肝移植仍是至今為止最有效的治療方法,然而,供體缺乏、手術(shù)復(fù)雜、費用較高等缺點使其難以廣泛開展,因此生物人工肝等各種體外支持系統(tǒng)、細(xì)胞移植這些方法逐步成為治療上述末期肝臟疾病的重要手段,以暫時取代肝臟功能,為肝移植創(chuàng)造條件。生物材料作為生物人工肝的重要組成部分,它能為細(xì)胞提供類似胞外基質(zhì)的微環(huán)境,使肝細(xì)胞等貼壁細(xì)胞能夠有效維持其表型及功能,另外,通過調(diào)節(jié)材料的相關(guān)理化性質(zhì),能有效促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化并提高其功能,生物材料還能夠保護細(xì)胞免受缺氧與炎癥細(xì)胞等的損傷,使其成為理想的保護屏障,并用于細(xì)胞移植及培養(yǎng)。水凝膠材料是生物材料的一種,它是以水為分散介質(zhì),由親水性分子或共聚體交聯(lián)形成,具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),不溶于水的聚合物。水凝膠材料因具高含水量、良好生物相容性等突出優(yōu)點,至1960年來,逐漸被研究用于生物人工肝及肝組織工程中,同時材料相關(guān)理化特性,種類及設(shè)計方案選擇也成為該領(lǐng)域研究熱點。水凝膠材料在大體上可分成兩種：一種為天然水凝膠材料,此類材料由天然細(xì)胞外基質(zhì)提取獲得,具良好生物活性,但提純費用高、力學(xué)性質(zhì)不可控、重復(fù)性差等使其在使用上受到局限；另一種為合成水凝膠材料,該類材料在重復(fù)性及可調(diào)控性上具優(yōu)勢,但生物活性并不高。其次,應(yīng)用中各種化學(xué)交聯(lián)劑、物理交聯(lián)方法等對細(xì)胞都有不同程度的損傷。因此近年研究旨于通過溫和交聯(lián)方法將上述兩種材料聯(lián)合應(yīng)用,以獲得具有生物活性及重復(fù)性良好的可調(diào)節(jié)水凝膠材料。PEG為合成水凝膠材料,它易于操控、改性、修飾,且穩(wěn)定性好；而肝素是肝內(nèi)富含的多聚糖,結(jié)構(gòu)中具特殊結(jié)合域,能與各種蛋白、生長因子結(jié)合并使其緩慢釋放。因此,本研究通過將肝素改性,后經(jīng)麥克爾加成這一溫和化學(xué)反應(yīng)方法與支鏈丙烯酸化聚乙二醇(PEG)交聯(lián)形成一種混合型水凝膠,并對其進(jìn)行檢測,最后輔以微加工模具方法制成水凝膠微粒。為肝臟重構(gòu)及相關(guān)藥物分析提供一種較為理想的材料。目的：1.利用酰胺化反應(yīng)(碳二亞胺法),通過控制反應(yīng)物比例對肝素進(jìn)行改性,獲得各種轉(zhuǎn)化率的硫醇化肝素,為后續(xù)PEG-肝素水凝膠合成奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。2.經(jīng)麥克爾加成反應(yīng),通過調(diào)整肝素轉(zhuǎn)化率、前成膠液濃度等獲得不同力學(xué)性質(zhì)的水凝膠,并通過微加工模具制成水凝膠微粒,為肝臟組織工程提供一種較為理想的材料。方法：1.肝素改性：合成硫醇化肝素。(1)硫醇化肝素的制備：將分子量恒定的肝素(根據(jù)其結(jié)構(gòu)上羧基的數(shù)量)通過碳二業(yè)胺法,分別加入不同比例的EDC、HOBT及半胱胺混合,充分反應(yīng)后透析,然后加入DTT,斷裂二硫鍵,再次透析,凍干。最終將半胱胺連接于肝素結(jié)構(gòu)中的羧基上,獲得轉(zhuǎn)化率不同的硫醇化肝素。(2)硫醇化肝素(Hep-SH)的測定：定性測定：通過核磁共振氫譜檢測半胱胺上兩個甲基峰,與未改性肝素進(jìn)行比較,證明硫醇化肝素成功合成。定量測定：取一定量硫醇化肝素,通過紫外分光光度法,以L-半胱氨酸作為標(biāo)準(zhǔn)品,利用Ellman試劑測量其溶液在412nm處吸光度,然后計算出肝素轉(zhuǎn)化率。2.PEG-肝素水凝膠微粒制備及功能測試；(1)PEG-肝素水凝膠合成：將轉(zhuǎn)化率為30%、40%、50%的Hep-SH及丙烯酸化PEG按照巰基與丙烯酸基團1：1的比例混合,然后加入PBS充分混勻制得濃度分別為5wt%、10wt%、15wt%的前成膠液,置于37℃條件下,一段時間后,觀察其形態(tài)及硬度上的變化。(2)PEG-肝素水凝膠力學(xué)性質(zhì)測定：將轉(zhuǎn)化率為30%、40%、50%的Hep-SH及5wt%、10wt%、15wt%三種前驅(qū)液濃度兩兩組合分成9組,分別溶解于PBS中混勻,置于流變儀中,檢測條件為：間距=500μm、角速度=1 rad/s、拉力γ=0.1%、溫度為37-C,以測定水凝膠模量隨時間的變化。(3)水凝膠溶脹率測定：將上述分組交聯(lián)后水凝膠浸泡于PBS中2天,直至質(zhì)量不再變化,稱量記錄質(zhì)量(Ws),隨后將膠體冷凍干燥,完全脫去水分,稱量質(zhì)量(Wd),膠體溶脹率(Swelling ratios)=Ws/Wd,實驗重復(fù)3次； (4)PEG-肝素水凝膠形態(tài)及表征觀察：利用掃描電鏡觀察制備好的PEG-肝素水凝膠,觀測其表面狀態(tài)。(5)聚二甲基硅氧烷(PDMS)微型模具的制作：先以SU-8制成所需形狀模具,用普朗尼克酸處理模具后,將PDMS預(yù)聚體與固化劑按照質(zhì)量比為10：1充分混合,覆于其表面,充分除去氣泡后于70℃烤箱中過夜,成型后小心取下PDMS微模具,于電鏡下觀察其孔徑大小及均一性。 (6)制作PEG-肝素水凝膠微粒：將混勻后的水凝膠前成膠液置于PDMS為模具上,排出孔內(nèi)氣泡并充分填滿微孔后置于37℃、5%C02孵箱中孵育10-20分鐘,交聯(lián)成型后取出,在光鏡及掃描電鏡下進(jìn)行觀察。結(jié)果：1.肝素改性：合成硫醇化肝素。通過碳二亞胺反應(yīng),控制反應(yīng)中加入EDC、HOBT和半胱胺的比例,再用DTT斷裂反應(yīng)中形成的二硫鍵,成功將半胱胺分子連接至肝素結(jié)構(gòu)中,制備出轉(zhuǎn)化率不同的硫醇化肝素。利用紫外分光光度法和核磁共振氫譜檢測對產(chǎn)物進(jìn)行定量及定性檢測,鑒定結(jié)果表明肝素改性成功：核磁共振氫譜檢測提示：相對于空白對照(未改性肝素),在2.6ppm及2.8ppm附近,經(jīng)改性肝素出現(xiàn)明顯吸收峰,與半胱胺結(jié)構(gòu)上兩個碳原子吸收峰位置相同,同時隨著比例增加,轉(zhuǎn)化率升高,吸收峰峰值增大；紫外分光光度法提示：隨著EDC、HOBT和半胱胺加入比例升高,硫醇化肝素在412nm處吸光度增強,通過計算得出,肝素結(jié)構(gòu)中羧基轉(zhuǎn)化率為30%--50%,各組間轉(zhuǎn)化率有顯著性差異(P0.05)；以上檢查結(jié)果都說明肝素改性成功,在結(jié)構(gòu)上引入巰基,并且隨著反應(yīng)物投入比例增加,肝素上羧基轉(zhuǎn)化率增加。2.PEG-肝素水凝膠及水凝膠微粒制備及功能測試；將不同轉(zhuǎn)化率的硫醇化肝素及支鏈丙烯酸化PEG按巰基：丙烯酸基=1：1比例混合溶于PBS,制成濃度不同的水凝膠前成膠液。在37℃條件下除30%-5wt%組(肝素轉(zhuǎn)化率為30%,前成膠液濃度為5%)在1小時內(nèi)不能交聯(lián)外,其余實驗組在5-30分鐘內(nèi)都可成功交聯(lián)形成水凝膠。流變學(xué)結(jié)果提示,30%-5wt%組在測量過程中彈性模量無明顯變化,未成功交聯(lián),其余實驗組隨著轉(zhuǎn)化率及濃度升高,膠體彈性模量(G’)可從-3.5×102Pa至-2.2-104Pa,并且交聯(lián)時間亦有所減少。溶脹率測定提示,隨著轉(zhuǎn)化率和濃度提高,水凝膠溶脹率不斷降低,由18.38+0.23至8.88±0.26,膠體含水量降低,析因分析轉(zhuǎn)化率、濃度對溶脹率的影響,結(jié)果證明不同轉(zhuǎn)化率之間有顯著性差異(P0.05),不同濃度之間有顯著性差異(P0.05),而濃度及轉(zhuǎn)化率之間并無明顯交互作用(P0.05)。在綜合其彈性模量、交聯(lián)時間及溶脹率等因素參考,認(rèn)為30%-10wt%及50%-5wt%兩組更具可實施性及接近肝臟情況,前者交聯(lián)時間成膠時間約10min、彈性模量G’約1.6×104Pa,后者約20min、G’約1.5×103Pa,并且兩者溶脹率都在較高水平。隨后通過將上述水凝膠前成膠液置于PDMS微加工模具中,成功制成PEG-肝素水凝膠微粒(上底1001μm,高及下底為300μm類臺柱形),在光鏡和掃描電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)水凝膠微粒形狀統(tǒng)一,表面光滑,脫水后的水凝膠則呈攣縮狀。結(jié)論：通過碳二亞胺法,成功將半胱胺分子連接于肝素分子結(jié)構(gòu)中,使肝素中含有巰基,通過調(diào)整EDC、HOBT及半胱胺比例,可獲得不同轉(zhuǎn)化率的硫醇化肝素。將硫醇化肝素按巰基：丙烯酸基=1：1的比例混合溶于PBS中,在37-C條件下,除30%-5wt%組外,其余各實驗組都能在30min內(nèi)交聯(lián)形成膠體。并且隨轉(zhuǎn)化率及前成膠液濃度提高,獲得水凝膠彈性模量上升,交聯(lián)時間縮短。溶脹率測定提示,隨著濃度及轉(zhuǎn)化率的提高,溶脹率降低,提示水凝膠含水量降低。綜合時間、彈性模量、溶脹率等參數(shù),我們認(rèn)為30%-10%wt及50%-5%wt兩組更具可實施性及接近肝臟情況,前者交聯(lián)時間制成t約10min、G’約1.6×104Pa,后者t約20min、G’約1.5×103Pa。最后,利用PDMS制成微加工模具,成功并將PEG-肝素水凝膠制成約300μm大小的微粒。本研究中,我們成功制備PEG-肝素水凝膠,它具有天然材料及合成材料各自的優(yōu)點,合成方法溫和,通過轉(zhuǎn)化率及濃度的控制,可獲得不同力學(xué)性質(zhì)的水凝膠。通過微加工模具方法,能有效控制水凝膠形狀,制成不同大小的微粒。因此該材料有望用于生物人工肝、肝細(xì)胞培養(yǎng)、藥物測試等復(fù)雜器官組織工程中。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R657.3;R318.08

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