發(fā)布時間：2017-11-28 06:44

  本文關(guān)鍵詞：慢病毒介導(dǎo)BMPs基因促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞成骨作用的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：背景和目的： 骨再生是治療骨骼系統(tǒng)相關(guān)疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié),而大塊骨缺損的修復(fù)是骨科醫(yī)生最常遇見的臨床問題。組織工程骨有望解決植骨后新骨形成緩慢的問題,近年來,組織工程技術(shù)的發(fā)展日趨成熟,使得骨缺損的修復(fù)成為可能,其中如何促進(jìn)種子細(xì)胞的增殖和成骨分化成為組織工程技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和研究熱點(diǎn)。理想的組織工程化骨必須具備以下三個要素：種子細(xì)胞、細(xì)胞因子和支架材料。在促進(jìn)骨形成的眾多調(diào)節(jié)因子中,骨形成蛋白(BMPs)家族在胚胎發(fā)育及骨骼形成中扮演重要的角色。目前發(fā)現(xiàn)的BMP家族成員骨誘導(dǎo)活性中研究較多的有BMP、BMP、BMP-6、BMP-7、BMP-9等。目的：針對小鼠BMP-2、BMP-4、 BMP-6、BMP-7、BMP-9基因設(shè)計(jì)、構(gòu)建第三代自體失活BMPs慢病毒表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細(xì)胞,構(gòu)建成骨誘導(dǎo)因子基因修飾的小鼠類間充質(zhì)干細(xì)胞,觀察感染后細(xì)胞各基因和蛋白的干擾效率；觀察感染后細(xì)胞體外成骨分化的影響；評價各成骨誘導(dǎo)因子的成骨分化能力。 方法： 以cDNA文庫為模版,應(yīng)用PCR方法獲得BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, BMP9,基因的編碼序列,經(jīng)大腸桿菌轉(zhuǎn)化后抽取質(zhì)粒,構(gòu)建基因表達(dá)質(zhì)粒載體,酶切鑒定重組體并且經(jīng)測序進(jìn)一步確定。然后用pLP/VSVG, pLP2, pLPl質(zhì)粒與BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, BMP9共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞。包裝pELNS-BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, BMP9后轉(zhuǎn)染小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞,GFP熒光證實(shí)轉(zhuǎn)染效果。茜素紅染色檢測鈣結(jié)節(jié),Western-Blot和Real time PCR檢測成骨相關(guān)基因的表達(dá)(Runx2)的表達(dá)水平,鑒定各成骨誘導(dǎo)因子的單獨(dú)轉(zhuǎn)染效能。最后用雙基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染(共7組)MC3T3-E1細(xì)胞,GFP熒光證實(shí)轉(zhuǎn)染效果；應(yīng)用ELISA檢測MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)上清中BGP和ALP的表達(dá)水平；應(yīng)用Real time PCR檢測Runx2mRNA的表達(dá)水平；應(yīng)用Western blot檢測BMP2,BMP4, BMP6, BMP7, BMP9蛋白的表達(dá)水平,鑒定雙基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染的成骨分化效能。 結(jié)果： pELNS-BMP2, pELNS-BMP4, pELNS-BMP6, pELNS-BMP7, pELNS-BMP9表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。重組慢病毒pELNS-BMP2, pELNS-BMP4, pELNS-BMP6, pELNS-BMP7, pELNS-BMP9構(gòu)建成功,成功轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細(xì)胞；Runx2表達(dá)水平：BMP2BMP4BMP9BMP7BMP6;茜素紅染色顯示BMP-2鈣結(jié)節(jié)數(shù)量最多。雙基因(共8組)聯(lián)合轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細(xì)胞,GFP熒光證實(shí)轉(zhuǎn)染成功；Runx2mRNA表達(dá)水平：T5T3T1T2T6T4T7; BGP表達(dá)：T5T3T4T6T2T1T7; ALP表達(dá)：T5T3T1T2T4T6T7;結(jié)果顯示,T5(BMP2, BMP7)共轉(zhuǎn)染成骨效率最高,Western blot證實(shí)BMP2和BMP7聯(lián)合轉(zhuǎn)染MP3T3-E1細(xì)胞后BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, BMP9蛋白表達(dá)升高。 結(jié)論： 第三代慢病毒載體pELNS可將BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, BMP9導(dǎo)入小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞MC3T3-E1,使其有效的表達(dá)；各成骨誘導(dǎo)因子能促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化,BMP2和BMP7雙基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染能有效提高成骨轉(zhuǎn)化,這為組織工程骨重建研究提供了重要的理論依據(jù)和技術(shù)支持。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R318.08

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1233005