本文關鍵詞：柞蠶絲素蛋白的陽離子化及其用作基因載體的初步研究

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【摘要】：促進微血管網絡的再生，提高支架的成活率，是皮膚真皮等含血管組織的再生修復領域需要亟待解決的關鍵問題。將分子生物學和組織工程技術相結合用促進血管再生的生長因子基因轉染細胞，使相應的生長因子得到穩(wěn)定、高效表達，是促進血管再生的有效途徑。VEGF165和Ang-1是兩種最重要的且僅以血管內皮細胞為靶細胞的促血管再生生長因子。研究證明聯(lián)合使用Ang-1和VEGF165雙基因既有利于相互協(xié)調共同促進血管的形成，，又可使新生血管獲得持久穩(wěn)定的結構。尋找合適的可降解性生物材料作為基因傳遞載體，使目的基因靶向、可控并有效地表達，是基因治療血管再生及皮膚組織工程等領域共同關注的問題。 柞蠶絲素是一種低免疫原性的物質，能被完全降解成多肽和游離氨基酸。柞蠶絲素蛋白含有細胞特異性黏附RGD序列，且含有較多的帶極性側鏈的氨基酸殘基能夠作為化學改性的潛在反應位點，這些優(yōu)點及特性為柞蠶絲素蛋白作為基因載體的可行性提供了物質基礎。 本文用精胺對柞蠶絲素蛋白進行化學修飾，使改性后的柞蠶絲素蛋白在生理環(huán)境下帶正電荷，得到陽離子化的柞蠶絲素蛋白(CASF)。并以陽離子化的柞蠶絲素蛋白作為VEGF165和Ang-1雙基因共表達質粒的傳遞載體。 首先通過碳化二亞胺法(EDC)使精胺接枝于柞蠶絲素蛋白。Zeta電位分析結果表明，經精胺改性后，相同pH條件下水溶液中柞蠶絲素蛋白的Zeta電位從負值上升到7.92，當精胺與柞蠶絲素的質量比大于8%后，絲素的Zeta電位上升幅度減小。紅外吸收光譜顯示精胺與柞蠶絲素蛋白中羧基反應，生成酰胺鍵。三硝基苯磺酸法(TNBS)證實了修飾過后的柞蠶絲素蛋白中伯氨基含量有所增加。并且精胺改性后，柞蠶絲素蛋白的分子構象發(fā)生了無規(guī)卷曲和α-螺旋結構向β-折疊結構的明顯轉變。 其次采用堿裂解法提取質粒DNA，并通過靜電吸附制備陽離子化絲素/DAN復合物。研究結果表明，陽離子化的柞蠶絲素能與DNA形成帶正電的復合物，并且形成的復合物為緊密的顆粒狀，粒徑分布在100-500nm。 最后MTT法檢測復合物的細胞相容性，研究結果表明用陽離子化的柞蠶絲素包被質粒DNA比用PEI包被質粒DNA的細胞毒性小。激光共聚焦顯微鏡(LSCM)和流式細胞儀檢測GFP陽性細胞比率結果表明，陽離子化的柞蠶絲素蛋白可以作為VEGF165和Ang-1雙基因共表達質粒的傳遞載體，并且C8-ASF/DNA(48:1)組的復合物轉染L929細胞與hy.EA926細胞的轉染效率分別為15.28%，32.88%，均明顯高于PEI/DNA組的轉染效率。 通過本文的研究，首次使用陽離子化的柞蠶絲素蛋白共同作為VEGF165和Ang-1雙基因共表達質粒的傳遞載體轉染成纖維細胞、血管內皮細胞，研究結果表明陽離子化的柞蠶絲素蛋白可以用作基因傳遞載體，為組織工程及原位組織再生領域的血管再生提供了一種新的基因傳遞載體。
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R318.08

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