本文關(guān)鍵詞：新型可降解鎂鈣鍶合金體外生物學(xué)性能的研究

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【摘要】：研究背景近年來(lái),隨著交通行業(yè)、運(yùn)輸行業(yè)、建筑行業(yè)等行業(yè)快速發(fā)展和我國(guó)全民老齡化的到來(lái),骨折的發(fā)病率也日益增多,因而導(dǎo)致骨折后需要植入鋼板等內(nèi)固定的患者也越來(lái)越多。目前臨床常用的鈦合金、不銹鋼、鈷鉻合金等永久性骨植入材料,但這些植入材料具有容易造成應(yīng)力遮擋、延緩骨折的愈合、治愈后需二次手術(shù)、磨屑和毒性金屬陽(yáng)離子引發(fā)炎性反應(yīng)等缺點(diǎn)。鎂合金是一種新型的生物可降解金屬材料,具有較高的比強(qiáng)度和比剛度,適宜的密度及力學(xué)性能,能有效緩解應(yīng)力遮擋效應(yīng)等優(yōu)點(diǎn),具有廣泛的醫(yī)用價(jià)值,但由于鎂在機(jī)體內(nèi)降解速率過(guò)快,難以維持穩(wěn)固效果,并在腐蝕過(guò)程中產(chǎn)生大量的氫氣,導(dǎo)致其臨床應(yīng)用受限。合金化可顯著提高鎂合金的耐蝕性能,是目前醫(yī)用鎂合金應(yīng)用研究的重點(diǎn)。但一些元素具合金元素對(duì)人體有害的,如鋁對(duì)神經(jīng)元有害,與癡呆、阿爾茲海默病有關(guān)；鐠、鈰、釔等稀土元素有肝毒性,鋯和鈰有細(xì)胞毒性,鋰有潛在的致畸作用。因而新型醫(yī)用鎂合金的體系設(shè)計(jì)與研發(fā)理念最理想是基于合金元素?zé)o毒性的考慮。基于北京大學(xué)材料學(xué)院鄭玉峰教授前期大量的體內(nèi)、體外研究數(shù)據(jù)表明,鎂鈣合金(Mg-1.0wt% Ca alloy)具有良好的生物相容性和良好的抗腐蝕性能,是較為理想的鎂合金材料,但其動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,由于其降解速率仍然較快,無(wú)法維持足夠時(shí)長(zhǎng)的機(jī)械強(qiáng)度,因而如何讓植入材料的降解速度和骨折治愈速度／骨組織重建速度匹配,是當(dāng)前需著重解決的問(wèn)題。鍶元素是人體必需的、無(wú)毒性的微量元素之一,可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化和抑制破骨細(xì)胞活性,另有研究表明Sr可以明顯改善鎂的晶粒大小從而提高其耐腐蝕性能。因而我們提出將微量的鍶元素添加到鎂鈣合金材料中,希望即可提高其耐腐蝕性能及機(jī)械強(qiáng)度,又具有明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的作用,因而設(shè)計(jì)出四種新型的Mg-1Ca- x wt.%Sr合金材料,但要作為一種新型的醫(yī)用可降解金屬材料,其具體的生物學(xué)性能如何尚不清楚。研究目的體外條件下觀察四種鎂合金材料對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、成骨礦化及溶血的影響,初步評(píng)價(jià)材料的生物相容性及生物活性,驗(yàn)證其作為一種新型醫(yī)用可降解金屬材料的安全性及有效性,為后期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用提供依據(jù)；隨后進(jìn)一步探討鎂鈣鍶合金介導(dǎo)成骨分化的信號(hào)通路。研究方法1.材料的表征：通過(guò)ICP-AES分析材料的化學(xué)組成,通過(guò)光鏡及掃描電鏡觀察材料的表面形貌,并用能譜分析儀及X線衍射儀檢測(cè)材料晶界的組成及化學(xué)成分,通過(guò)pHS-2C數(shù)字式酸度計(jì)測(cè)定浸提液的pH值,通過(guò)蛋白早期粘附實(shí)驗(yàn)研究材料對(duì)蛋白的吸附能力。2.生物相容性試驗(yàn)：按照IS010993-12標(biāo)準(zhǔn)(試樣表面積/浸體介質(zhì)=1.25cm2/ml)分別制備各種材料浸提液并培養(yǎng)細(xì)胞,空白對(duì)照組采用含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。采用細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)含量判斷有無(wú)細(xì)胞毒性,倒置顯微鏡觀察各種浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài),MTT法檢測(cè)四種材料對(duì)細(xì)胞相對(duì)增殖率的影響,溶血試驗(yàn)判斷四種材料對(duì)血液紅細(xì)胞的有無(wú)溶血反應(yīng),根據(jù)上述結(jié)果從而綜合評(píng)價(jià)四種鎂合金材料的生物安全性。3.成骨礦化：采用對(duì)硝基苯磷酸酯法(p-NPP)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)總蛋白及ALP活性,茜素紅染色法觀察礦化結(jié)節(jié)形成并進(jìn)行定量分析,天狼星紅染色觀察膠原的分泌并進(jìn)行定量分析,進(jìn)一步采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)成骨相關(guān)基因的表達(dá)。4.成骨信號(hào)通路：通過(guò)Western Blotting檢測(cè)細(xì)胞成骨分化MAPK信號(hào)通路中p-ERK1/2、p-JNK、p-P38蛋白的表達(dá)。研究結(jié)果1.1.材料的表征1.1.1 通過(guò)ICP-AES分析得出四種材料的成分和元素含量基本為Mg-1. Owt%-x wt.%Sr(x=0.2,0.5,1.0,2.0)四種合金材料,與我們理想設(shè)計(jì)時(shí)的基本一致。1.1.2 光鏡下金相圖可見(jiàn)四種材料隨著鍶含量的增加,隨著合金中Sr元素含量的不斷增加,合金的晶粒不斷細(xì)化,材料中晶粒更加均勻細(xì)致。1.1.3電子掃描電鏡合金中Sr元素含量的不斷增加,合金的晶粒不斷細(xì)化,合金的晶界不斷從斷續(xù)狀向連續(xù)的網(wǎng)狀變化,且合金的晶界同時(shí)會(huì)發(fā)生粗化形成片狀化現(xiàn)象。能譜分析儀可見(jiàn)鎂鈣鍶合金的晶界內(nèi)由大量的Ca和Sr組成,說(shuō)明鈣鍶主要以以第二相的形式存在于晶界內(nèi)。1.1.4 XRD分析儀得出四種鎂合金主要由α-Mg, Mg2Ca和Mg17Sr2。隨著Sr含量的增加,第二相中Mg17Sr2的含量也隨之增多。1.1.5 PH分析儀檢測(cè)其浸提液的PH值可知,四種材料隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng),其PH值均成上升趨勢(shì),但所有的值均在8-11之間。1.1.5 蛋白粘附試驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)四種材料表面對(duì)蛋白的粘附無(wú)明顯差異(p0.05)。1.2材料的生物相容性1.2.1 四種材料浸提液試樣與MC3T3-E1細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)4h后,各種材料的LDH活性與空白對(duì)照組分別為(906.9±105.1)U/L,(956.7±156.2)U/L,(906.0±123.9)u/L,(925.8±40.5)u/L和(967.0±106.9)U/L,五組數(shù)據(jù)之間無(wú)明顯差異(P0.05),說(shuō)明四種材料均無(wú)細(xì)胞毒性。1.2.2 四種材料浸提液試樣與MC3T3-E1細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)72h后,倒置熒光顯微鏡下觀察四種材料浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞貼壁良好,呈正常生長(zhǎng),形態(tài)呈梭形,胞漿內(nèi)可見(jiàn)少量離散的黑色顆粒,未見(jiàn)明顯細(xì)胞溶解等,符合0級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。1.2.3 細(xì)胞增殖活力檢測(cè)提示,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),各組0D值逐漸升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),不同時(shí)間點(diǎn)組內(nèi)差異未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),不同的時(shí)間點(diǎn)各組與空白對(duì)照組也未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；1.2.4 根據(jù)四種材料浸提液與細(xì)胞共培養(yǎng)1,4,7d后計(jì)算其相對(duì)增值率顯示,Mg-1Ca-0.2Sr合金,Mg-1Ca-0.5Sr合金,Mg-1Ca-1.0Sr合金,Mg-1Ca-2.0Sr合金在第一天的細(xì)胞增值率為93.2%,88.3%,104.2%,94.6%。Mg-1Ca-0.2Sr合金,Mg-1Ca-0.5Sr合金,Mg-1Ca-1.0Sr合金,Mg-1Ca-2.0Sr合金在第四天的細(xì)胞增值率為88.9%,82.1%,89.1%,101.5%。Mg-1Ca-0.2Sr合金,Mg-1Ca-0.5Sr合金,Mg-1Ca-1.0Sr合金,Mg-1Ca-2.0Sr合金在第四天的細(xì)胞增值率為91.8%,98.3%,93.7%,104.5%%。四種材料的毒性評(píng)價(jià)為0級(jí)或1級(jí),是合格的生物材料。1.2.5 溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Mg-1.0wt%-x wt.%Sr(x=0.2,0.5,1.0,2.0)合金材料的溶血率依次為(%)：0.21,1.48,1.05,2.01,四種材料的溶血率均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(5%)。1.3 成骨分化1.3.1 四種材料組和空白組的胞內(nèi)蛋白總量無(wú)明顯差異,ALP活性檢測(cè)結(jié)果顯示,Mg-1.0Ca-0.5Sr、Mg-1.0Ca-1.0Sr、Mg-1.0Ca-2.0Sr三組合金OD值高于空白對(duì)照組(control group)組,且三組差異均有顯著性(P0.05),組間比較發(fā)現(xiàn)Mg-1.0Ca-2.0Sr合金0D值明顯高于其他三組,并有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。1.3.2 茜素紅染色結(jié)果顯示：從圖中可以發(fā)現(xiàn)Mg-1.0Ca-2.0Sr浸提液培養(yǎng)的培養(yǎng)基內(nèi)可見(jiàn)大量紅染的礦化結(jié)節(jié)生成,礦化程度最高,與對(duì)照組及其他三組材料均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。表明Mg-1.0Ca-2.0Sr表面可促進(jìn)前成骨MC3T3-E1細(xì)胞礦化。1.3.3 天狼星紅染色結(jié)果顯示：從圖中可以發(fā)現(xiàn)Mg-1.0Ca-2.0Sr浸提液培養(yǎng)的培養(yǎng)基內(nèi)可見(jiàn)細(xì)胞外基質(zhì)染色最為深染,膠原分泌最多,定量分析結(jié)果表明：Mg-1.0Ca-2.0Sr與對(duì)照組及其他三種材料均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。表明Mg-1.0Ca-2.0Sr表面可促進(jìn)前成骨MC3T3-E1細(xì)胞外基質(zhì)的膠原分泌。1.3.4 RT-PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果顯示：Mg-1.0Ca-2.0Sr合金能明顯促進(jìn)ALP、OCN、RUNX2、OSX、BMP-2基因的表達(dá),同時(shí)發(fā)現(xiàn)Mg-1.0Ca-2.0Sr能抑制OPN基因的表達(dá)。1.4 成骨分化的信號(hào)通路1.4.1 通過(guò)Western Blotting法檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：ERK1/2通路在加入Mg-1.0Ca-2.0Sr合金材料浸提液后5min時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)磷酸化的ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白表達(dá)量的增加,至30min最為明顯出現(xiàn)一個(gè)蛋白表達(dá)量峰值隨后出現(xiàn)下降,而磷酸化的JNK和P38蛋白在5min,15min,30min and 60min一直保持低平,表達(dá)量未見(jiàn)明顯增多。因而初步推斷鎂鈣鍶合金促成骨分化可能通過(guò)MAPK信號(hào)通路的ERK1/2通路介導(dǎo)的.結(jié)論1.四種鎂合金材料均由α-Mg, Mg2Ca和Mg17Sr2這些化合物組成,只是隨著材料中鍶含量的增加,其Mg17Sr2的含量出現(xiàn)增加,另外隨著鍶含量的增加,材料表面的晶粒大小以得到明顯細(xì)化；2.四種材料表面早期蛋白黏附的結(jié)果無(wú)明顯差異；3.四種鎂鈣鍶合金材料均可通過(guò)細(xì)胞毒性評(píng)價(jià),表現(xiàn)出良好的生物相容性,均為理想的植入材料；4.四種材料的溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果均低于5%,具有良好的血液相容性；5. Mg-1.0Ca-2.0Sr合金較其他三種材料更能能促進(jìn)細(xì)胞成骨分化、礦化、膠原分泌及成骨相關(guān)基因表達(dá),顯示出良好的骨誘導(dǎo)活性；6. Mg-1.0Ca-2.0Sr合金可能通過(guò)MAPK信號(hào)通路中的ERK1/2通路刺激成骨細(xì)胞的成骨分化；7.鎂鈣鍶合金體內(nèi)生物安全性及成骨分化等實(shí)驗(yàn)本課題尚未涉及,因而其能否成為一種新型可降解內(nèi)植入材料有待后期實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R318.08

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 張馳;;成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Osterix對(duì)骨形成作用的分子機(jī)制(英文)[J];北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2012年05期

2 王甫厚,陳紹先,郭彩云,謝少文;LDH釋放法測(cè)NK細(xì)胞毒的方法學(xué)研究[J];中國(guó)免疫學(xué)雜志;1990年02期

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本文編號(hào)：1161585