本文關鍵詞：新型可降解鎂鈣鍶合金體外生物學性能的研究

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【摘要】：研究背景近年來,隨著交通行業(yè)、運輸行業(yè)、建筑行業(yè)等行業(yè)快速發(fā)展和我國全民老齡化的到來,骨折的發(fā)病率也日益增多,因而導致骨折后需要植入鋼板等內(nèi)固定的患者也越來越多。目前臨床常用的鈦合金、不銹鋼、鈷鉻合金等永久性骨植入材料,但這些植入材料具有容易造成應力遮擋、延緩骨折的愈合、治愈后需二次手術、磨屑和毒性金屬陽離子引發(fā)炎性反應等缺點。鎂合金是一種新型的生物可降解金屬材料,具有較高的比強度和比剛度,適宜的密度及力學性能,能有效緩解應力遮擋效應等優(yōu)點,具有廣泛的醫(yī)用價值,但由于鎂在機體內(nèi)降解速率過快,難以維持穩(wěn)固效果,并在腐蝕過程中產(chǎn)生大量的氫氣,導致其臨床應用受限。合金化可顯著提高鎂合金的耐蝕性能,是目前醫(yī)用鎂合金應用研究的重點。但一些元素具合金元素對人體有害的,如鋁對神經(jīng)元有害,與癡呆、阿爾茲海默病有關；鐠、鈰、釔等稀土元素有肝毒性,鋯和鈰有細胞毒性,鋰有潛在的致畸作用。因而新型醫(yī)用鎂合金的體系設計與研發(fā)理念最理想是基于合金元素無毒性的考慮。基于北京大學材料學院鄭玉峰教授前期大量的體內(nèi)、體外研究數(shù)據(jù)表明,鎂鈣合金(Mg-1.0wt% Ca alloy)具有良好的生物相容性和良好的抗腐蝕性能,是較為理想的鎂合金材料,但其動物實驗表明,由于其降解速率仍然較快,無法維持足夠時長的機械強度,因而如何讓植入材料的降解速度和骨折治愈速度／骨組織重建速度匹配,是當前需著重解決的問題。鍶元素是人體必需的、無毒性的微量元素之一,可促進成骨細胞增殖、分化和抑制破骨細胞活性,另有研究表明Sr可以明顯改善鎂的晶粒大小從而提高其耐腐蝕性能。因而我們提出將微量的鍶元素添加到鎂鈣合金材料中,希望即可提高其耐腐蝕性能及機械強度,又具有明顯促進成骨細胞分化的作用,因而設計出四種新型的Mg-1Ca- x wt.%Sr合金材料,但要作為一種新型的醫(yī)用可降解金屬材料,其具體的生物學性能如何尚不清楚。研究目的體外條件下觀察四種鎂合金材料對細胞生長、增殖、成骨礦化及溶血的影響,初步評價材料的生物相容性及生物活性,驗證其作為一種新型醫(yī)用可降解金屬材料的安全性及有效性,為后期動物實驗及臨床應用提供依據(jù)；隨后進一步探討鎂鈣鍶合金介導成骨分化的信號通路。研究方法1.材料的表征：通過ICP-AES分析材料的化學組成,通過光鏡及掃描電鏡觀察材料的表面形貌,并用能譜分析儀及X線衍射儀檢測材料晶界的組成及化學成分,通過pHS-2C數(shù)字式酸度計測定浸提液的pH值,通過蛋白早期粘附實驗研究材料對蛋白的吸附能力。2.生物相容性試驗：按照IS010993-12標準(試樣表面積/浸體介質(zhì)=1.25cm2/ml)分別制備各種材料浸提液并培養(yǎng)細胞,空白對照組采用含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。采用細胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)含量判斷有無細胞毒性,倒置顯微鏡觀察各種浸提液培養(yǎng)的細胞形態(tài),MTT法檢測四種材料對細胞相對增殖率的影響,溶血試驗判斷四種材料對血液紅細胞的有無溶血反應,根據(jù)上述結(jié)果從而綜合評價四種鎂合金材料的生物安全性。3.成骨礦化：采用對硝基苯磷酸酯法(p-NPP)檢測細胞內(nèi)總蛋白及ALP活性,茜素紅染色法觀察礦化結(jié)節(jié)形成并進行定量分析,天狼星紅染色觀察膠原的分泌并進行定量分析,進一步采用RT-PCR技術檢測細胞內(nèi)成骨相關基因的表達。4.成骨信號通路：通過Western Blotting檢測細胞成骨分化MAPK信號通路中p-ERK1/2、p-JNK、p-P38蛋白的表達。研究結(jié)果1.1.材料的表征1.1.1 通過ICP-AES分析得出四種材料的成分和元素含量基本為Mg-1. Owt%-x wt.%Sr(x=0.2,0.5,1.0,2.0)四種合金材料,與我們理想設計時的基本一致。1.1.2 光鏡下金相圖可見四種材料隨著鍶含量的增加,隨著合金中Sr元素含量的不斷增加,合金的晶粒不斷細化,材料中晶粒更加均勻細致。1.1.3電子掃描電鏡合金中Sr元素含量的不斷增加,合金的晶粒不斷細化,合金的晶界不斷從斷續(xù)狀向連續(xù)的網(wǎng)狀變化,且合金的晶界同時會發(fā)生粗化形成片狀化現(xiàn)象。能譜分析儀可見鎂鈣鍶合金的晶界內(nèi)由大量的Ca和Sr組成,說明鈣鍶主要以以第二相的形式存在于晶界內(nèi)。1.1.4 XRD分析儀得出四種鎂合金主要由α-Mg, Mg2Ca和Mg17Sr2。隨著Sr含量的增加,第二相中Mg17Sr2的含量也隨之增多。1.1.5 PH分析儀檢測其浸提液的PH值可知,四種材料隨著浸泡時間的延長,其PH值均成上升趨勢,但所有的值均在8-11之間。1.1.5 蛋白粘附試驗觀察發(fā)現(xiàn)四種材料表面對蛋白的粘附無明顯差異(p0.05)。1.2材料的生物相容性1.2.1 四種材料浸提液試樣與MC3T3-E1細胞復合培養(yǎng)4h后,各種材料的LDH活性與空白對照組分別為(906.9±105.1)U/L,(956.7±156.2)U/L,(906.0±123.9)u/L,(925.8±40.5)u/L和(967.0±106.9)U/L,五組數(shù)據(jù)之間無明顯差異(P0.05),說明四種材料均無細胞毒性。1.2.2 四種材料浸提液試樣與MC3T3-E1細胞復合培養(yǎng)72h后,倒置熒光顯微鏡下觀察四種材料浸提液培養(yǎng)的細胞貼壁良好,呈正常生長,形態(tài)呈梭形,胞漿內(nèi)可見少量離散的黑色顆粒,未見明顯細胞溶解等,符合0級標準。1.2.3 細胞增殖活力檢測提示,隨著培養(yǎng)時間的延長,各組0D值逐漸升高具有統(tǒng)計學意義(P0.05),不同時間點組內(nèi)差異未見明顯統(tǒng)計學意義(P0.05),不同的時間點各組與空白對照組也未見明顯統(tǒng)計學差異(P0.05)；1.2.4 根據(jù)四種材料浸提液與細胞共培養(yǎng)1,4,7d后計算其相對增值率顯示,Mg-1Ca-0.2Sr合金,Mg-1Ca-0.5Sr合金,Mg-1Ca-1.0Sr合金,Mg-1Ca-2.0Sr合金在第一天的細胞增值率為93.2%,88.3%,104.2%,94.6%。Mg-1Ca-0.2Sr合金,Mg-1Ca-0.5Sr合金,Mg-1Ca-1.0Sr合金,Mg-1Ca-2.0Sr合金在第四天的細胞增值率為88.9%,82.1%,89.1%,101.5%。Mg-1Ca-0.2Sr合金,Mg-1Ca-0.5Sr合金,Mg-1Ca-1.0Sr合金,Mg-1Ca-2.0Sr合金在第四天的細胞增值率為91.8%,98.3%,93.7%,104.5%%。四種材料的毒性評價為0級或1級,是合格的生物材料。1.2.5 溶血實驗結(jié)果表明Mg-1.0wt%-x wt.%Sr(x=0.2,0.5,1.0,2.0)合金材料的溶血率依次為(%)：0.21,1.48,1.05,2.01,四種材料的溶血率均符合國家標準(5%)。1.3 成骨分化1.3.1 四種材料組和空白組的胞內(nèi)蛋白總量無明顯差異,ALP活性檢測結(jié)果顯示,Mg-1.0Ca-0.5Sr、Mg-1.0Ca-1.0Sr、Mg-1.0Ca-2.0Sr三組合金OD值高于空白對照組(control group)組,且三組差異均有顯著性(P0.05),組間比較發(fā)現(xiàn)Mg-1.0Ca-2.0Sr合金0D值明顯高于其他三組,并有明顯統(tǒng)計學差異(P0.05)。1.3.2 茜素紅染色結(jié)果顯示：從圖中可以發(fā)現(xiàn)Mg-1.0Ca-2.0Sr浸提液培養(yǎng)的培養(yǎng)基內(nèi)可見大量紅染的礦化結(jié)節(jié)生成,礦化程度最高,與對照組及其他三組材料均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。表明Mg-1.0Ca-2.0Sr表面可促進前成骨MC3T3-E1細胞礦化。1.3.3 天狼星紅染色結(jié)果顯示：從圖中可以發(fā)現(xiàn)Mg-1.0Ca-2.0Sr浸提液培養(yǎng)的培養(yǎng)基內(nèi)可見細胞外基質(zhì)染色最為深染,膠原分泌最多,定量分析結(jié)果表明：Mg-1.0Ca-2.0Sr與對照組及其他三種材料均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。表明Mg-1.0Ca-2.0Sr表面可促進前成骨MC3T3-E1細胞外基質(zhì)的膠原分泌。1.3.4 RT-PCR檢測成骨相關基因表達結(jié)果顯示：Mg-1.0Ca-2.0Sr合金能明顯促進ALP、OCN、RUNX2、OSX、BMP-2基因的表達,同時發(fā)現(xiàn)Mg-1.0Ca-2.0Sr能抑制OPN基因的表達。1.4 成骨分化的信號通路1.4.1 通過Western Blotting法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)：ERK1/2通路在加入Mg-1.0Ca-2.0Sr合金材料浸提液后5min時開始出現(xiàn)磷酸化的ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白表達量的增加,至30min最為明顯出現(xiàn)一個蛋白表達量峰值隨后出現(xiàn)下降,而磷酸化的JNK和P38蛋白在5min,15min,30min and 60min一直保持低平,表達量未見明顯增多。因而初步推斷鎂鈣鍶合金促成骨分化可能通過MAPK信號通路的ERK1/2通路介導的.結(jié)論1.四種鎂合金材料均由α-Mg, Mg2Ca和Mg17Sr2這些化合物組成,只是隨著材料中鍶含量的增加,其Mg17Sr2的含量出現(xiàn)增加,另外隨著鍶含量的增加,材料表面的晶粒大小以得到明顯細化；2.四種材料表面早期蛋白黏附的結(jié)果無明顯差異；3.四種鎂鈣鍶合金材料均可通過細胞毒性評價,表現(xiàn)出良好的生物相容性,均為理想的植入材料；4.四種材料的溶血實驗結(jié)果均低于5%,具有良好的血液相容性；5. Mg-1.0Ca-2.0Sr合金較其他三種材料更能能促進細胞成骨分化、礦化、膠原分泌及成骨相關基因表達,顯示出良好的骨誘導活性；6. Mg-1.0Ca-2.0Sr合金可能通過MAPK信號通路中的ERK1/2通路刺激成骨細胞的成骨分化；7.鎂鈣鍶合金體內(nèi)生物安全性及成骨分化等實驗本課題尚未涉及,因而其能否成為一種新型可降解內(nèi)植入材料有待后期實驗進一步驗證。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R318.08

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 張馳;;成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Osterix對骨形成作用的分子機制(英文)[J];北京大學學報(醫(yī)學版);2012年05期

2 王甫厚,陳紹先,郭彩云,謝少文;LDH釋放法測NK細胞毒的方法學研究[J];中國免疫學雜志;1990年02期

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本文編號：1161585