本文關鍵詞：利用SD大鼠脂肪間充質干細胞體外構建成骨細胞膜片、血管內(nèi)皮細胞膜片的研究

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【摘要】：目的:利用SD大鼠脂肪間充質干細胞體外誘導分化培養(yǎng),獲得具有成骨、成血管潛能的雙細胞膜片,為血管化組織工程骨的構建提供部分實驗依據(jù)和理論基礎。方法:取SD大鼠附睪及背側脂肪組織,0.1%Ⅰ型膠原酶消化分離獲得脂肪間充質干細胞(ADSCs),傳代培養(yǎng)以獲得較為純凈的ADSCs。流式細胞術鑒定其表面分子CD29、CD44、CD31、CD45的表達;分別向脂肪細胞、成骨細胞、成軟骨細胞誘導分化,油紅O、茜素紅、阿利新藍染色定性檢測其多項分化能力。將ADSCs以1x10~6/cm~2密度接種,用成骨誘導分化培養(yǎng)基(含50μg/ml抗壞血酸)持續(xù)培養(yǎng),觀察膜片的形成過程和形成情況,將獲得的細胞膜片行SEM、TEM、HE及vonkossa染色檢測其成骨性能。利用內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基(EGM-2)(含50ng/ml VEGF)將ADSCs體外向內(nèi)皮細胞誘導分化,誘導14-21天后,流式細胞術鑒定細胞表面分子CD44、CD29、CD31、CD34;Matrigel基質膠檢測內(nèi)皮細胞體外成血管功能。將ADSCs以1x10~6/cm~2密度接種,用EGM-2培養(yǎng)基(含50μg/ml抗壞血酸和50ng/ml VEGF)持續(xù)培養(yǎng),觀察膜片的形成過程和形成情況,將獲得的細胞膜片行HE染色、TEM及免疫熒光CD31染色檢測其成血管性能。結果:原代ADSCs呈短梭形及多角形,培養(yǎng)3代后,細胞呈均一的長梭形。流式細胞術鑒定顯示ADSCs高度表達CD29、CD44,基本不表達CD31、CD34。將ADSCs分別向脂肪細胞、成骨細胞、成軟骨細胞誘導分化,染色定性檢測顯示油紅O染色陽性;堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,alp)alp染色、茜素紅染色、vonkossa硝酸銀染色陽性;阿利新藍染色陽性。ADSCs以高密度(1×10~6/cm~2)接種于成骨誘導分化培養(yǎng)基(含50μg/ml抗壞血酸)中持續(xù)培養(yǎng),14天后可成功獲得細胞膜片。HE染色見膜片由大量成骨細胞及細胞外基質構成;掃描電鏡顯示細胞被自己所分泌的細胞外基質包埋,基質中可見大量礦化結節(jié)聚集;透射電鏡顯示細胞外基質內(nèi)針狀鈣鹽結晶沉積;Vonkossa硝酸銀染色陽性,這些結果均表明該膜片具有潛在的成骨能力。ADSCs以高密度(1×10~6/cm~2)接種于EGM-2培養(yǎng)基(含50μg/ml抗壞血酸、50ng/ml VEGF)中持續(xù)培養(yǎng),16天后可成功獲得細胞膜片。HE染色可見膜片由大量內(nèi)皮細胞及細胞外基質構成;透射電鏡顯示細胞內(nèi)可見內(nèi)皮細胞特殊結構Weibel-Palade小體;免疫熒光CD31染色陽性,這些均表明該膜片具有潛在的成血管能力。結論:1.大鼠脂肪間充質干細胞可以定向分化為成骨細胞,高濃度持續(xù)成骨細胞誘導培養(yǎng)后可獲得細胞膜片,且該膜片可能具有潛在的成骨能力。2.大鼠脂肪間充質干細胞可以定向分化為內(nèi)皮細胞,高濃度持續(xù)成內(nèi)皮細胞誘導培養(yǎng)后可獲得細胞膜片,且該膜片可能具有潛在的成血管能力。3.分別獲取脂肪間充質干細胞來源的具有成骨能力的細胞膜片及成血管能力的細胞膜片,為血管化組織工程骨的構建奠定一定的實驗依據(jù)和理論基礎。
【學位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R318

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