本文關(guān)鍵詞：利用SD大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞體外構(gòu)建成骨細(xì)胞膜片、血管內(nèi)皮細(xì)胞膜片的研究

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【摘要】：目的:利用SD大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化培養(yǎng),獲得具有成骨、成血管潛能的雙細(xì)胞膜片,為血管化組織工程骨的構(gòu)建提供部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。方法:取SD大鼠附睪及背側(cè)脂肪組織,0.1%Ⅰ型膠原酶消化分離獲得脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs),傳代培養(yǎng)以獲得較為純凈的ADSCs。流式細(xì)胞術(shù)鑒定其表面分子CD29、CD44、CD31、CD45的表達(dá);分別向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化,油紅O、茜素紅、阿利新藍(lán)染色定性檢測(cè)其多項(xiàng)分化能力。將ADSCs以1x10~6/cm~2密度接種,用成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(含50μg/ml抗壞血酸)持續(xù)培養(yǎng),觀察膜片的形成過(guò)程和形成情況,將獲得的細(xì)胞膜片行SEM、TEM、HE及vonkossa染色檢測(cè)其成骨性能。利用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(EGM-2)(含50ng/ml VEGF)將ADSCs體外向內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化,誘導(dǎo)14-21天后,流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面分子CD44、CD29、CD31、CD34;Matrigel基質(zhì)膠檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞體外成血管功能。將ADSCs以1x10~6/cm~2密度接種,用EGM-2培養(yǎng)基(含50μg/ml抗壞血酸和50ng/ml VEGF)持續(xù)培養(yǎng),觀察膜片的形成過(guò)程和形成情況,將獲得的細(xì)胞膜片行HE染色、TEM及免疫熒光CD31染色檢測(cè)其成血管性能。結(jié)果:原代ADSCs呈短梭形及多角形,培養(yǎng)3代后,細(xì)胞呈均一的長(zhǎng)梭形。流式細(xì)胞術(shù)鑒定顯示ADSCs高度表達(dá)CD29、CD44,基本不表達(dá)CD31、CD34。將ADSCs分別向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化,染色定性檢測(cè)顯示油紅O染色陽(yáng)性;堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,alp)alp染色、茜素紅染色、vonkossa硝酸銀染色陽(yáng)性;阿利新藍(lán)染色陽(yáng)性。ADSCs以高密度(1×10~6/cm~2)接種于成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(含50μg/ml抗壞血酸)中持續(xù)培養(yǎng),14天后可成功獲得細(xì)胞膜片。HE染色見(jiàn)膜片由大量成骨細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成;掃描電鏡顯示細(xì)胞被自己所分泌的細(xì)胞外基質(zhì)包埋,基質(zhì)中可見(jiàn)大量礦化結(jié)節(jié)聚集;透射電鏡顯示細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)針狀鈣鹽結(jié)晶沉積;Vonkossa硝酸銀染色陽(yáng)性,這些結(jié)果均表明該膜片具有潛在的成骨能力。ADSCs以高密度(1×10~6/cm~2)接種于EGM-2培養(yǎng)基(含50μg/ml抗壞血酸、50ng/ml VEGF)中持續(xù)培養(yǎng),16天后可成功獲得細(xì)胞膜片。HE染色可見(jiàn)膜片由大量?jī)?nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成;透射電鏡顯示細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞特殊結(jié)構(gòu)Weibel-Palade小體;免疫熒光CD31染色陽(yáng)性,這些均表明該膜片具有潛在的成血管能力。結(jié)論:1.大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞可以定向分化為成骨細(xì)胞,高濃度持續(xù)成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)后可獲得細(xì)胞膜片,且該膜片可能具有潛在的成骨能力。2.大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞可以定向分化為內(nèi)皮細(xì)胞,高濃度持續(xù)成內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)后可獲得細(xì)胞膜片,且該膜片可能具有潛在的成血管能力。3.分別獲取脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的具有成骨能力的細(xì)胞膜片及成血管能力的細(xì)胞膜片,為血管化組織工程骨的構(gòu)建奠定一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R318

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