本文關(guān)鍵詞：基于特異性相互作用的基因活性組織修復(fù)材料的構(gòu)建及性能研究

  更多相關(guān)文章： 特異性相互作用 基因活性 生物素-親和素 基因轉(zhuǎn)染 纖維蛋白原 knob-hole 水凝膠

【摘要】：組織修復(fù)再生材料中生物活性信號的仿生釋放,是獲得類天然組織的關(guān)鍵。隨著基因技術(shù)的發(fā)展,在基因水平調(diào)控細(xì)胞行為成為可能。負(fù)載了治療性基因的組織修復(fù)材料,即基因活性支架,可實(shí)現(xiàn)基因的高效負(fù)載、定域轉(zhuǎn)染,因而逐漸成為研究的新方向。但較低的轉(zhuǎn)染效率限制了基因活性支架材料的研究與應(yīng)用。轉(zhuǎn)染效率是基因從基質(zhì)材料中解離到進(jìn)入細(xì)胞核眾多過程共同作用的結(jié)果。DNA從材料中的解離是轉(zhuǎn)染的第一步,但是這一部分研究報道比較少。因此,本文的核心思想是：從仿生學(xué)角度出發(fā),將特異性相互作用引入到基因活性材料體系,通過調(diào)節(jié)DNA與材料的結(jié)合方式,研究結(jié)合方式對DNA轉(zhuǎn)染效率的影響。 首先將生物素-親和素特異性相互作用引入材料體系。成功的將生物素接枝到了聚乙烯亞胺上(B-PEI),接枝率11.7%。B-PEI可通過靜電相互作用與DNA絡(luò)合為納米粒子；當(dāng)N/P=5時,B-PEI/DNA粒子的粒徑為170nm,電位為16.1mV,透射電鏡下粒子呈現(xiàn)密實(shí)的球形結(jié)構(gòu)。原子力顯微鏡(AFM)與熒光顯微鏡結(jié)果顯示,利用生物素-親和素間的特異性相互作用,DNA粒子可以成功的負(fù)載到玻璃或硅片表面；基底上DNA負(fù)載密度高達(dá)935ng/cm2,比物理吸附的高3倍。通過特異性相互作用固定的DNA粒子具有緩釋作用；當(dāng)加入過量自由生物素分子時,大量的DNA會從基底表面釋放出來。在自由生物素存在的條件下,固定了DNA粒子的基底材料的轉(zhuǎn)染效率達(dá)6.6%,遠(yuǎn)高于對照組。 本文基于纖維蛋白原分子中knob-hole間的特異性相互作用,構(gòu)建了原位自組裝水凝膠體系。成功的將knob多肽接枝到了透明質(zhì)酸(HA)分子上,接枝率為18.72%。通過調(diào)節(jié)Knob-g-HA與纖維蛋白原的用量比,發(fā)現(xiàn)當(dāng)knob:hole=1.2:1時,該體系可以形成原位自組裝水凝膠。掃頻流變結(jié)果顯示,當(dāng)knob:hole=1.2:1時,混合體系的儲存模量始終大于損耗模量,且隨著纖維蛋白原濃度的提高,儲存模量逐漸增大且變化幅度較為平穩(wěn)。SEM結(jié)果顯示,水凝膠呈現(xiàn)織狀微觀結(jié)構(gòu),具有良好的貫通性。水凝膠溶脹曲線顯示,該體系的溶脹速率與溶脹度均高于蜂窩狀結(jié)構(gòu)的對照組,溶脹率為270%。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,該體系對NIH-3T3細(xì)胞具有較低的毒性。 基于上一節(jié)對knob-hole司特異性相互作用的初步了解,進(jìn)一步考察該作用在制備基因活性水凝膠材料中的應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)N/P=10,DNA濃度為62.5μg/mL、纖維蛋白原濃度為50mg/mL,可以制備基于knob-hole特異性相互作用的以基因納米粒子為交聯(lián)點(diǎn)的纖維蛋白原/透明質(zhì)酸水凝膠,且可以在毫米級保持形狀。由濁度法檢測該體系的凝膠時間約為5-10min,水凝膠具有貫通的多孔性微觀結(jié)構(gòu),DNA以納米粒子的形式均勻的分布在水凝膠中,DNA釋放速率較為緩慢,釋放時間達(dá)35天。包封在該體系中的細(xì)胞,隨著培養(yǎng)時間的延長,生長速率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。同時發(fā)現(xiàn),該基因活性水凝膠與細(xì)胞共培養(yǎng)3d后可以實(shí)現(xiàn)基因的有效轉(zhuǎn)染,且轉(zhuǎn)染的細(xì)胞大都集中在細(xì)胞聚集體中。
【關(guān)鍵詞】：特異性相互作用 基因活性 生物素-親和素 基因轉(zhuǎn)染 纖維蛋白原 knob-hole 水凝膠
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R318.08
【目錄】：

• 致謝6-8
• 摘要8-10
• Abstract10-15
• 1 引言15-38
• 1.1 組織工程概述15-16
• 1.2 組織工程三要素16-21
• 1.2.1 支架16-18
• 1.2.2 種子細(xì)胞18-19
• 1.2.3 生物活性信號及其傳遞19-21
• 1.3 基因活性組織修復(fù)材料21-26
• 1.3.1 基因治療在組織工程中的應(yīng)用22
• 1.3.2 基因負(fù)載形式22-26
• 1.4 特異性相互作用及其在基因活性支架中的應(yīng)用26-36
• 1.4.1 特異性相互作用概述27-28
• 1.4.2 特異性相互作用在材料制備中的應(yīng)用28-29
• 1.4.3 生物素-親和素特異性相互作用及其應(yīng)用29-31
• 1.4.4 纖維蛋白原交聯(lián)機(jī)理及knob-hole特異性相互作用31-36
• 1.4.4.1 纖維蛋白原概述31
• 1.4.4.2 纖維蛋白原應(yīng)用領(lǐng)域31-34
• 1.4.4.3 纖維蛋白原聚合機(jī)理34-36
• 1.5 課題的提出36-38
• 2 基于生物素-親和素特異性相互作用的二維基因活性體系的構(gòu)建38-50
• 2.1 實(shí)驗(yàn)部分38-42
• 2.1.1 主要原料與試劑38-39
• 2.1.2 生物素化聚乙烯亞胺(B-PEI)的制備39
• 2.1.3 B-PEI/DNA復(fù)合粒子的制備與性能39-40
• 2.1.4 生物素化基底的制備40
• 2.1.5 B-PEI/DNA復(fù)合粒子在生物素化基底表面的負(fù)載40-41
• 2.1.6 DNA釋放行為41
• 2.1.7 HEK 293細(xì)胞培養(yǎng)41
• 2.1.8 細(xì)胞毒性41
• 2.1.9 細(xì)胞轉(zhuǎn)染性能41-42
• 2.1.10 統(tǒng)計(jì)分析42
• 2.2 B-PEI的表征42-43
• 2.3 B-PEI/DNA復(fù)合粒子理化性能表征43-44
• 2.4 生物素化基底材料的表征44-45
• 2.5 B-PEI/DNA復(fù)合粒子在生物素化基底表面的負(fù)載45-46
• 2.6 B-PEI/DNA復(fù)合粒子的釋放行為46-47
• 2.7 細(xì)胞毒性47-48
• 2.8 基因轉(zhuǎn)染性能48-49
• 2.9 本章小結(jié)49-50
• 3 基于knob-hole相互作用的自組裝水凝膠的制備及性能50-60
• 3.1 實(shí)驗(yàn)部分50-53
• 3.1.1 主要原料與試劑50-51
• 3.1.2 甲基丙烯酸酯化的透明質(zhì)酸(MeHA)、多肽修飾的透明質(zhì)酸(Knob-g-HA)的制備與表征51
• 3.1.3 水凝膠形成條件的探索51-52
• 3.1.4 水凝膠的機(jī)械性能表征52
• 3.1.5 水凝膠微觀結(jié)構(gòu)的表征52
• 3.1.6 水凝膠的溶脹性能測試52-53
• 3.1.7 細(xì)胞培養(yǎng)53
• 3.1.8 統(tǒng)計(jì)分析53
• 3.2 MeHA、Knob-g-HA的核磁表征結(jié)果53-55
• 3.3 水凝膠的形成55
• 3.4 水凝膠的流變行為55-56
• 3.5 水凝膠的微觀結(jié)構(gòu)56-57
• 3.6 水凝膠的溶脹動力學(xué)57
• 3.7 細(xì)胞毒性57-59
• 3.8 本章小結(jié)59-60
• 4 基于knob-hole相互作用的原位自組裝基因活性水凝膠的制備及性能60-71
• 4.1 實(shí)驗(yàn)部分60-63
• 4.1.1 主要原料與試劑60-61
• 4.1.2 DNA/PEI/Fibrinogen復(fù)合粒子的制備與表征61
• 4.1.3 DNA/PEI/Fibrinogen復(fù)合粒子為交聯(lián)點(diǎn)的水凝膠體系的制備61
• 4.1.4 凝膠動力學(xué)表征61-62
• 4.1.5 水凝膠的微觀結(jié)構(gòu)62
• 4.1.6 DNA粒子在水凝膠中的分布情況62
• 4.1.7 DNA釋放行為62
• 4.1.8 細(xì)胞培養(yǎng)62
• 4.1.9 細(xì)胞毒性62
• 4.1.10 基因轉(zhuǎn)染性能62-63
• 4.1.11 統(tǒng)計(jì)分析63
• 4.2 DNA/PEI/Fbrinogen復(fù)合粒子的制備與理化性能的表征63-64
• 4.3 水凝膠的形成64-65
• 4.4 水凝膠凝膠動力學(xué)65
• 4.5 基因活性水凝膠的微觀結(jié)構(gòu)65-66
• 4.6 DNA粒子在水凝膠中的分布66-67
• 4.7 DNA釋放行為67-68
• 4.8 細(xì)胞毒性68-69
• 4.9 基因轉(zhuǎn)染性能69
• 4.10 本章小結(jié)69-71
• 全文總結(jié)71-72
• 建議與展望72-74
• 參考文獻(xiàn)74-84
• 作者簡介84

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 趙劍英;李玉邯;郭海全;高連勛;;生物芯片表面氨基密度檢測及穩(wěn)定性研究[J];分析化學(xué);2006年09期

，

本文編號：1113186