本文關(guān)鍵詞：藍(lán)白斑篩選技術(shù)的改進(jìn)及其生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用

  更多相關(guān)文章： 藍(lán)白斑篩選 TAcloning 反因子蛋白酶（TALENs） EGFR基因

【摘要】：目的：探討藍(lán)白斑篩選技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)方面的新應(yīng)用：（1）TALENs（transcription activator-like effector nucleases）活性檢測(cè)和脫靶效應(yīng)評(píng)估；（2）檢測(cè)EGFR基因外顯子19堿基缺失突變新方法。 方法：設(shè)計(jì)合成一系列片段長(zhǎng)度小于150bp的插入片段，將插入片段與兩種T/A克隆載體（pGEM-T Easy vector和pTrueBlue vector，具有不同的插入位點(diǎn)，分別位于密碼子7和另一個(gè)是密碼子11和36之間）連接，，進(jìn)行分子克隆，進(jìn)一步觀察菌落顏色并通過測(cè)序驗(yàn)證；人工構(gòu)建基于藍(lán)白斑篩選的含有TALENs靶序列的報(bào)告質(zhì)粒，進(jìn)一步提出一種原核水平檢測(cè)TALENs有效性方法的可能性；設(shè)計(jì)一組特異性PCR引物，以樣本DNA（如人工構(gòu)建的EGFR野生型、突變型質(zhì)粒、腫瘤組織DNA、血中游離DNA等）為模板進(jìn)行PCR，進(jìn)一步進(jìn)行分子克隆。結(jié)合藍(lán)白斑篩選，人為改變閱讀框架，致使野生型閱讀框架中含有終止密碼子TAA，缺失突變型因丟失一段核酸片段而不含有終止密碼子TAA，從而通過觀察菌落的顏色來確定樣品有無EGFR基因外顯子19的堿基缺失突變。 結(jié)論：基于兩種不同插入位點(diǎn)的TA克隆載體（pGEM-T Easy vector和pTrueBlue vector），若插入片段若是3的整數(shù)倍則菌落呈藍(lán)色；若是3的非整數(shù)倍則菌落呈白色。因此，理論上插入或缺失突變?nèi)魧?dǎo)致LacZ閱讀框移碼則呈現(xiàn)菌落藍(lán)色變?yōu)榘咨默F(xiàn)象。成功構(gòu)建2種含有TALENs靶序列的報(bào)告質(zhì)粒，2種質(zhì)粒的LacZ閱讀框分別為移碼與非移碼，對(duì)應(yīng)菌落顏色為白色、藍(lán)色；在此基礎(chǔ)上提出一種檢測(cè)TALENs有效性的方法，即當(dāng)TALENs特異性剪切藍(lán)白斑篩選載體上的靶序列時(shí)，導(dǎo)致多肽閱讀框的非移碼與移碼變換，從而共轉(zhuǎn)化后菌落顏色改變。該體系還可廣泛應(yīng)用于鋅指蛋白核酸酶（zinc finger nucleases，ZFNs），CRISPR-cas系統(tǒng)（CRISPR Cas systems）有效性檢測(cè)。分別以人工構(gòu)建的EGFR野生型、突變型質(zhì)粒、肺癌腫瘤組織基因組DNA為模板進(jìn)行PCR、分子克隆，結(jié)果顯示野生型插入片段分子克隆的菌落為白色，突變型插入片段分子克隆的菌落為藍(lán)色。
【關(guān)鍵詞】：藍(lán)白斑篩選 TAcloning 反因子蛋白酶（TALENs） EGFR基因
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R318
【目錄】：

• 中文摘要4-5
• Abstract5-8
• 研究背景8-10
• 第一部分 探究TrueBlue技術(shù)，發(fā)現(xiàn)新規(guī)律10-21
• 材料和方法10-15
• 結(jié)果15-19
• 討論19-21
• 第二部分 藍(lán)白斑篩選技術(shù)生物應(yīng)用（1）---TALENs活性檢測(cè)和脫靶效應(yīng)評(píng)估技術(shù)21-30
• 前言21-24
• 材料與方法24-26
• 結(jié)果26-27
• 討論27-30
• 第三部分 藍(lán)白斑篩選技術(shù)生物應(yīng)用（2）---檢測(cè)EGFR基因外顯子19的堿基缺失突變新方法30-40
• 前言30-31
• 材料與方法31-35
• 結(jié)果35-38
• 討論38-40
• 結(jié)論40-41
• 參考文獻(xiàn)41-43
• 綜述43-64
• Reference58-64
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的文章64-65
• 中英文縮略詞表65-66
• 致謝66-67

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1 潘韻芝;藍(lán)白斑篩選技術(shù)的改進(jìn)及其生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用[D];蘇州大學(xué);2014年

2 王一錚;盤基網(wǎng)柄菌KAx-3細(xì)胞和AK127細(xì)胞mRNA差異顯示分析[D];華東師范大學(xué);2007年

3 陸燕欣;p100蛋白及其片段重組質(zhì)粒的構(gòu)建與表達(dá)[D];天津醫(yī)科大學(xué);2009年

4 陳剛;限制性內(nèi)切酶標(biāo)準(zhǔn)化-BamH I[D];北京化工大學(xué);2012年

本文編號(hào)：1089460