發(fā)布時間：2017-10-08 02:11

  本文關(guān)鍵詞：Frizzled4在小鼠毛囊生長周期中角質(zhì)形成細胞的表達及其功能研究

  更多相關(guān)文章： 毛囊 生長周期 角質(zhì)形成細胞 Frizzled4蛋白

【摘要】：毛囊是皮膚組織重要而復(fù)雜的附屬器官，它由上皮和真皮成分組成，上皮成分包括毛母質(zhì)、外根鞘和內(nèi)根鞘，真皮成分包括毛乳頭和真皮鞘。從細胞的組成上講毛囊包括了角質(zhì)形成細胞、毛乳頭細胞、真皮鞘細胞、黑素細胞及Langerhans細胞等20多種細胞。毛囊的發(fā)育、生長及周期變化是通過上皮和真皮的相互對話、相互作用而實現(xiàn)。根據(jù)毛囊生長形態(tài)的變化，毛囊周期分為三個階段：生長期，退化期及靜止期。多種活性蛋白、細胞因子、激素參與了毛囊周期性生長的調(diào)節(jié)，同時它也受到多種信號途徑的調(diào)控，目前研究較多的是Wnt、Bmp、Shh及Notch信號等，其中Wnt信號通路是維持毛囊周期性生長的重要信號通路，Wnt蛋白通過與Wnt信號的Frizzled受體結(jié)合影響了下游的信號傳遞和靶基因的激活。Wnt信號受體Frizzled蛋白在毛囊中的定位反映著Wnt信號的作用部位，因而在毛囊的周期性變化過程中同樣也發(fā)揮著重要作用。到目前為止在脊椎動物中發(fā)現(xiàn)了至少10個Frizzled家族成員，對于它們的研究目前也并不清楚，已有關(guān)于Frizzled1、2、3、5、6、7、10在毛囊生長期中研究,但對其在毛囊周期中的變化及作用未做進一步研究，另外有文獻表明Frizzled4表達于毛囊黑色干細胞中，，但對于Frizzled4是否在毛囊角質(zhì)形成細胞的表達及其功能尚未見報道。 目的 初步探討Frizzled4在毛囊生長周期中毛囊角質(zhì)形成細胞中的表達規(guī)律及其在毛囊中的可能作用。 方法 本研究從以下幾個方面展開實驗:取生長期早期——出生后1d（P1d）和P3d，生長期中期P8d，退化期P16d和靜止期P21d的C57BL/6雌性小鼠背部皮膚，采用免疫熒光(immunofluorescence,IF)、實時定量PCR和RT-PCR、Western blot等多種實驗手段檢測Frizzled4在小鼠毛囊周期中的表達；通過免疫熒光檢測角蛋白K14與Frizzled4在毛囊中是否存在共表達,以確定Frizzled4是否存在于毛囊角質(zhì)形成細胞中；針對體外功能研究實驗，以小鼠皮膚上皮細胞JB6cl30-7b為研究對象，首先利用免疫熒光技術(shù)檢測了Frizzled4蛋白在JB6cl30-7b細胞膜上表達,然后利用抗Frizzled4抗體（1:100）對小鼠皮膚上皮細胞干預(yù)后采用MTT、BrdU檢測細胞的增殖情況；最后利用拔毛模型來誘導(dǎo)毛囊再生，利用免疫熒光來檢驗Frizzled4在再生毛囊周期（拔毛后P5d、P10d、P20d及P25d）中的表達，探討再生過程中Frizzled4的表達規(guī)律。 結(jié)果 一、Frizzled4在毛囊周期中表達變化 1、免疫熒光檢測Frizzled4蛋白的定位，結(jié)果顯示Frizzled4蛋白表達于毛囊角質(zhì)形成細胞的細胞中,其表達部位隨著周期變化而變化:在生長期Frizzled4蛋白主要分布于毛囊Bulge部位、外根鞘、毛球部外側(cè)、內(nèi)根鞘、前皮質(zhì)（precortex），且隨著毛囊的生長分化，表達量逐漸增多。在退化期Frizzled4表達量減少，主要表達于Bulge、外根鞘上段、部分內(nèi)根鞘。到了靜止期只有少許陽性細胞集中在毛囊Bulge處。 2、Western blot檢測Frizzled4蛋白在毛囊周期皮膚中表達量的變化，結(jié)果顯示：Frizzled4蛋白在小鼠出生后的第一天（P1d）的背部皮膚中就表達較明顯，在第三天（P3d）Frizzled4蛋白表達明顯上調(diào)。與P3d相比，P8d小鼠背部皮膚中Frizzled4蛋白的表達繼續(xù)上調(diào)。隨后在退化期（P16d），F(xiàn)rizzled4蛋白表達下調(diào)顯著。當(dāng)毛囊進入靜止期（P21d），小鼠背部皮膚中Frizzled4蛋白表達微弱，明顯低于P1d、P3d、P8d、P16d。 3、熒光定量PCR、半定量RT-PCR檢測Frizzled4mRNA在不同毛囊周期皮膚中表達量的變化，結(jié)果顯示Frizzled4mRNA表達和蛋白的表達趨勢基本一致，表現(xiàn)為生長期最豐富，退化期減弱，靜止期最低。 二、在細胞水平檢測Frizzled4對毛囊角質(zhì)形成細胞增殖的影響 1、細胞免疫熒光檢測Frizzled4蛋白的表達，結(jié)果顯示Frizzled4表達于小鼠皮膚上皮細胞JB6cl30-7b的細胞膜。 2、在JB6cl30-7b細胞培養(yǎng)液中分別加入5μg/mL、10μg/mL和20μg/mL的Frizzled4抗體，以相同濃度的同型IgG作為實驗對照，24h后利用MTT檢測吸光度值。MTT結(jié)果顯示：與對照組相比，5μg/mL抗Frizzled4抗體處理的細胞其吸光度值沒有顯著變化，而10μg/mL抗Frizzled4抗體處理后吸光度值明顯降低，20μg/mL抗Frizzled4抗體處理后的吸光度值降到最低。結(jié)果表明抗Frizzled4抗體促使JB6cl30-7b細胞增殖能力降低，且隨著濃度的增加，對細胞的增殖抑制越明顯。 3、BrdU結(jié)果顯示，抗Frizzled4抗體同樣使JB6cl30-7b細胞增殖能力降低。 三、外因誘導(dǎo)下Frizzled4在毛囊中的表達 Frizzled4蛋白在外因誘導(dǎo)下的毛囊再生中的表達與毛囊生長一致（即在生長期表達最多，到退化期表達降低，在靜止期表達最低），與自然周期表達基本一致。 結(jié)論 本課題首次檢測了Frizzled4蛋白在小鼠毛囊周期中毛囊角質(zhì)形成細胞中的表達，通過體外細胞水平和動物在體水平，探索了其在角質(zhì)形成細胞中的作用，為下一步繼續(xù)深入研究并確定與Frizzled4結(jié)合的Wnt蛋白及其激活的下游信號通路做好了鋪墊，為毛發(fā)生長以及毛囊再生的調(diào)控研究提供一定的理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：毛囊 生長周期 角質(zhì)形成細胞 Frizzled4蛋白
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R751
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• Abstract5-8
• 摘要8-11
• 第一章 前言11-15
• 第二章 Frizzled4 在小鼠毛囊生長周期中角質(zhì)形成細胞的表達規(guī)律15-36
• 2.1 引言15
• 2.2 材料與方法15-27
• 2.3 結(jié)果27-32
• 2.4 討論32-34
• 2.5 小結(jié)34-36
• 第三章 體外干擾 Frizzled4 對毛囊生長的影響36-44
• 3.1 引言36
• 3.2 材料與方法36-39
• 3.3 結(jié)果39-41
• 3.4 討論41-43
• 3.5 小結(jié)43-44
• 第四章 外因誘導(dǎo)下 Frizzled4 在毛囊周期中的表達44-49
• 4.1 引言44
• 4.2 材料與方法44-46
• 4.3 結(jié)果46-48
• 4.4 討論48
• 4.5 小結(jié)48-49
• 全文總結(jié)49-50
• 參考文獻50-54
• 文獻綜述54-64
• 參考文獻60-64
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文64-65
• 致謝65

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 石家仲;楊恬;雷明星;李進;邱偉明;連小華;;gasdermin3在小鼠同步化毛囊周期中的表達[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2011年05期

2 陳星星;賀修勝;盧小敏;;卷曲蛋白受體與腫瘤的研究進展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展;2013年07期

本文編號：991385