本文關(guān)鍵詞：表皮腫瘤中缺氧誘導(dǎo)因子-1α與血管生成相關(guān)蛋白表達(dá)關(guān)系的研究

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【摘要】：第一部分表皮腫瘤中缺氧誘導(dǎo)因子-1α和血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)實驗?zāi)康模浩つw基底細(xì)胞癌(BCC)和皮膚鱗狀細(xì)胞癌(cSCC)在人類皮膚惡性腫瘤中是最常見的,其生長過程分為兩個階段,分別為無血管期和血管期,發(fā)展過程從無血管緩慢生長逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橛醒艿目焖俚脑鲩L,當(dāng)血液供應(yīng)不足,不能滿足腫瘤生長發(fā)育的需要時,將導(dǎo)致腫瘤內(nèi)部缺氧,從而引起一系列促進(jìn)血管新生因子的表達(dá)來誘導(dǎo)腫瘤產(chǎn)生新的血管的形成。腫瘤的發(fā)生發(fā)展離不開血液營養(yǎng)的供應(yīng),而新生血管的生成將保證腫瘤獲得充足的營養(yǎng)供給,導(dǎo)致腫瘤得以迅速生長并可對周圍組織浸潤、侵襲和發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。隨著研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)在腫瘤新生血管生成過程中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor, HIF-1α)發(fā)揮非常重要的作用。本項實驗研究的目的是探討皮膚基底細(xì)胞癌(BCC)及皮膚鱗狀細(xì)胞癌(cSCC)組織中缺氧誘導(dǎo)因子-1α (HIF-1α)與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá),并分析它們的相關(guān)性及臨床意義。實驗方法：收集我院病理科及皮膚病理研究室2010年1月-2014年12月存檔皮膚癌組織蠟塊,BCC 56例,cSCC46例,共102例,其中男性61例、女性41例,年齡中位數(shù)為58(26-90)歲。選擇同一時期采集的正常皮膚組織標(biāo)本40例做為對照,其中男性22例、女性18例,年齡中位數(shù)為44(20-68)歲。病例組與正常對照組,均無合并重要臟器疾病史,無放療及化療等治療病史。病例組與對照組之間年齡、性別等差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。取材部位分別來自頭面部、軀干、四肢及會陰等部位,應(yīng)用即用型快速免疫組化MaxVisionTM法檢測56例皮膚BCC、46例cSCC和40例采集的正常皮膚組織樣本中的HIF-1α和VEGF的表達(dá)。采用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,采用兩個樣本均數(shù)比較的t檢驗對計量資料進(jìn)行分析,采用x2檢驗和Scheffe方法對計數(shù)資料進(jìn)行分析,采用計算Spearman相關(guān)系數(shù)對不符合雙變量正態(tài)分布資料進(jìn)行分析,α=0.05作為顯著性水準(zhǔn),P0.05有顯著性差異,具有統(tǒng)計學(xué)意義。實驗結(jié)果：1 VEGF陽性染色主要定位在細(xì)胞的胞質(zhì)中,部分血管的內(nèi)皮細(xì)胞、外毛根鞘細(xì)胞也可見到弱表達(dá),新生血管旁的腫瘤細(xì)胞可見到高度表達(dá)。在皮膚基底細(xì)胞癌(BCC)中,VEGF蛋白的陽性表達(dá)率為33.93%(19/56)；在皮膚鱗狀細(xì)胞癌(cSCC)中,VEGF蛋白的陽性表達(dá)率為67.39%(31/46)；在正常皮膚中,VEGF蛋白表達(dá)率為12.50%(5/40)。與正常皮膚相比,在BCC和cSCC中VEGF呈現(xiàn)明顯的高表達(dá),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；并且VEGF的表達(dá)在cSCC中又明顯高于BCC(P0.05)。2HIF-1α陽性染色主要定位在腫瘤細(xì)胞胞漿中,也可偶見于胞核著色,在腫瘤壞死區(qū)域的周邊也可見到陽性細(xì)胞,在部分血管的內(nèi)皮細(xì)胞中也可見到陽性著色。正常皮膚則呈現(xiàn)陰性表達(dá)。在皮膚基底細(xì)胞癌(BCC)中,HIF-1α蛋白的陽性表達(dá)率為48.32%(27/56)；在皮膚鱗狀細(xì)胞癌(cSCC)中,HIF-1α蛋白的陽性表達(dá)率為82.60%(38/46)；在正常皮膚中,HIF-1α蛋白無表達(dá)。與正常皮膚相比較,在BCC和cSCC中,HIF-1α呈現(xiàn)明顯的高表達(dá),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3在BCC與cSCC中,VEGF陽性病例中有5例HIF-1α呈現(xiàn)陰性；HIF-1α陽性病例中有20例VEGF呈現(xiàn)陰性,兩者的表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.536,P0.05)。研究結(jié)論：在皮膚基底細(xì)胞癌(BCC)與皮膚鱗狀細(xì)胞癌(cSCC)中,VEGF和HIF-1 α高表達(dá),表明兩者通過促進(jìn)皮膚腫瘤新生血管的生成來促進(jìn)BCC與cSCC的生長、浸潤或向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。VEGF表達(dá)和HIF-1α表達(dá)呈正相關(guān),提示兩者在促進(jìn)BCC與cSCC的生長發(fā)展、浸潤或轉(zhuǎn)移中發(fā)揮協(xié)同作用。第二部分缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)小干擾RNA對皮膚腫瘤細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)影響實驗?zāi)康模捍蠖鄶?shù)研究表明,HIF-1α調(diào)控著缺氧誘導(dǎo)表達(dá)的多種基因如血管生成素、血小板源性生長因子、胎盤生長因子和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)等的生成,因而可將其作為缺氧的固有標(biāo)志并且可為腫瘤的發(fā)展提供一個更為準(zhǔn)確的檢測手段。前期實驗研究中發(fā)現(xiàn),在BCC和cSCC組織中,HIF-1α及其下游的靶基因VEGF的表達(dá)均是增高的,HIF-1α在VEGF啟動子上的位點與其結(jié)合,從而啟動VEGF的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),從而使腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境。在BCC和cSCC中,VEGF與HIF-1α的蛋白表達(dá)呈正相關(guān),提示兩者可共同促進(jìn)腫瘤血管的生成和細(xì)胞的增殖。目前,對于BCC和cSCC的治療,仍以手術(shù)方法為主,不適合手術(shù)或者有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者可行放療和化療。放療和化療雖能有效消滅腫瘤細(xì)胞,但很難實現(xiàn)精準(zhǔn)的靶向治療,在治療過程中導(dǎo)致很多正常細(xì)胞死亡,對人體造成損害。因此,實現(xiàn)腫瘤的靶向治療是重要的發(fā)展方向。先前的研究提示了缺氧機制可能參與了BCC和cSCC的發(fā)生和發(fā)展。鑒于HIF-1α在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的重要作用,人們越來越重視以HIF-1α為靶點的腫瘤生物治療方法,抑制腫瘤細(xì)胞HIF-1α基因的表達(dá),阻斷腫瘤細(xì)胞缺氧信號的傳遞等治療方法已成為新的研究方向,而針對HIF-1α靶基因的RNAi (RNA interference, RNAi)方法可以使其結(jié)構(gòu)域失活或者抑制HIF-1α基因的表達(dá),從而阻斷HIF-1α的生物學(xué)作用,將是一個有效的方法來控制惡性腫瘤的發(fā)展,提高患者的生存率。本實驗研究目的是通過RNAi方法抑制HIF-1α基因表達(dá),并探討HIF-1α-siRNA對皮膚腫瘤細(xì)胞中HIF-1α mRNA和VEGF mRNA及蛋白的表達(dá)水平的影響。實驗方法：采用廣州市銳博生物科技有限公司設(shè)計軟件,根據(jù)siRNA的設(shè)計原則,構(gòu)建目的基因的si RNA和陰性對照NC(Negative Control),其序列由廣州市銳博生物科技有限公司提供。構(gòu)建針對HIF-1α的特異性小干擾RNA,同時構(gòu)建轉(zhuǎn)染陰性對照組,采用瞬時轉(zhuǎn)染人皮膚鱗癌細(xì)胞A431細(xì)胞,在低氧狀態(tài)下培養(yǎng)3天,提取細(xì)胞總RNA和蛋白。采用RT-qPCR方法和Western blot方法檢測HIF-1α mRNA和VEGF mRNA及蛋白的表達(dá)水平變化。采用凝膠分析軟件分析條帶光密度值,計算RT-qPCR實驗結(jié)果,采用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目的蛋白與內(nèi)參β-actin條帶灰度值,表達(dá)Western Blot實驗結(jié)果。采用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件分析實驗數(shù)據(jù),計量資料兩個樣本均數(shù)比較應(yīng)用t檢驗,多組比較采用單因素方差分析,以α=0.05作為顯著性水準(zhǔn),P0.05有顯著性差異,具有統(tǒng)計學(xué)意義。實驗結(jié)果：1 RT-qPCR與Western Blot結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染HIF-1α-siRNA皮膚腫瘤細(xì)胞低氧培養(yǎng)后,與空轉(zhuǎn)染對照相比,siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3對HIF-1 a mRNA及蛋白表達(dá)均有抑制作用(P0.05)。2RT-qPCR與Western Blot實驗結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染HIF-1α-siRNA組與空轉(zhuǎn)染對照組、陰性轉(zhuǎn)染siRNA對照組相比,低氧培養(yǎng)人皮膚鱗癌細(xì)胞A431細(xì)胞中VEGF mRNA及蛋白表達(dá)水平均下降,有顯著性差異(P0.05)。研究結(jié)論：通過采用RNA干擾技術(shù)抑制HIF-1α基因的表達(dá),可以抑制低氧條件下皮膚鱗癌細(xì)胞與血管發(fā)生相關(guān)基因VEGF表達(dá)的上調(diào)機制,導(dǎo)致VEGF mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)均顯著下調(diào),這也證明了HIF-1α是通過轉(zhuǎn)錄激活途徑參與低氧誘導(dǎo)皮膚鱗癌細(xì)胞VEGF的生成,從而刺激腫瘤新的血管形成。下調(diào)低氧條件下培養(yǎng)皮膚鱗癌A431細(xì)胞中HIF-1α基因的表達(dá),可明顯抑制VEGF在基因和蛋白水平的表達(dá),由此可見,低氧狀態(tài)下皮膚鱗癌A431細(xì)胞中VEGF的表達(dá)受HIF-1α調(diào)控。
【關(guān)鍵詞】：皮膚基底細(xì)胞癌(BCC) 皮膚鱗狀細(xì)胞癌(cSCC) 血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) 缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α) RNA干擾(RNA interference RNAi) 小干擾RNA(siRNA) 人皮膚鱗癌細(xì)胞A431細(xì)胞 缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1 α) 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R739.5
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-16
• 符號說明16-18
• 前言18-26
• 第一部分：表皮腫瘤中缺氧誘導(dǎo)因子-1α與血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)26-40
• 研究背景26-27
• 實驗材料與方法27-30
• 實驗結(jié)果30-34
• 討論34-39
• 結(jié)論39-40
• 第二部分：缺氧誘導(dǎo)因子-1α小干擾RNA對皮膚腫瘤細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)影響40-58
• 研究背景40-42
• 實驗材料與方法42-51
• 實驗結(jié)果51-53
• 討論53-57
• 結(jié)論57-58
• 參考文獻(xiàn)58-66
• 致謝66-67
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄67-68
• 附文168-87
• 附文287-96
• 附表96

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本文編號：987829