本文關(guān)鍵詞：小鼠黑素瘤細胞exosomes誘導(dǎo)小鼠成纖維細胞侵襲能力的表達

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【摘要】：研究背景外泌體(exosomes)是真核細胞釋放的一種由磷脂雙層分子層構(gòu)成的類膜囊結(jié)構(gòu),它能將分子信號水平地從一個細胞傳遞至另一個細胞,影響受體細胞的功能和行為。Exosomes所包含的成分和攜帶的信息主要決定于其源細胞的特性。腫瘤細胞來源的exosomes具備完整的mRNAs、microRNAs、蛋白質(zhì),攜載腫瘤細胞信息。有研究表明,腫瘤可與周圍環(huán)境“cross-talk”影響周圍正常間質(zhì)細胞,使間質(zhì)細胞表型發(fā)生改變并釋放金屬蛋白酶及趨化因子,以降低細胞黏附力、破壞基底膜和促血管生成,有利于腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。在腫瘤細胞改造正常細胞的過程中,是否存在腫瘤細胞exosomes通訊方式?本課題以小鼠黑素瘤B16-F10細胞和其同源的C57小鼠胚胎成纖維細胞(MEF細胞)為材料,研究B16-F10細胞的exosomes對MEF細胞的侵襲遷移性的影響,驗證腫瘤細胞向正常細胞傳遞侵襲性的exosomes通訊方式,從exosomes細胞間通訊的角度,詮釋腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移性的現(xiàn)象,為尋求控制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的方法提供一種新的思路。目的1.確定B16-F10細胞exosomes的制備方法及其結(jié)構(gòu)特征。2.分析b16-f10細胞exosomes對mef的侵襲性的影響,驗證腫瘤細胞向正常細胞傳遞侵襲性的exosomes通訊方式。方法1.采用100000×g超速離心方法從b16-f10細胞培養(yǎng)上清液中分離提取exosomes,納米顆粒跟蹤分析法分析尺度分布,戊二醛固定、環(huán)氧樹脂包埋、枸櫞酸鉛染色后透射電鏡觀察exosomes超微結(jié)構(gòu),western-blot分析tsg101、tyrp2的表達情況。2.從13.5天c57小鼠胚胎分離純化小鼠胚胎成纖維細胞(mef)。將b16-f10細胞的exosomes與mef細胞共培養(yǎng),實時無標(biāo)記動態(tài)細胞分析技術(shù)(rtca)記錄不同濃度exosomes與mef共培養(yǎng)72小時mef細胞侵襲力和遷移力的動態(tài)變化。收集共培養(yǎng)48h的mef細胞,qpcr檢測細胞的mmp-2、mmp-9、e-cadherinmrna表達,western-blot檢測mmp-2、mmp-9、e-cadherin蛋白表達水平。采用cfse熒光染料示蹤exosomes,共聚焦熒光顯微鏡觀察exosomes與mef細胞的融合過程。結(jié)果1.100000×g超速離心法從b16-f10細胞分離出一種具有直徑約主要分布在90~430nm,平均粒徑為169.7±4.62nm的脂質(zhì)雙分子膜構(gòu)成的囊泡狀結(jié)構(gòu),并表達exosomes特征蛋白tsg101、黑素瘤特征蛋白tyrp2。2.b16-f10細胞exosomes與mef細胞共培養(yǎng)72h,exosomes濃度0.6g/l組mef細胞侵襲力最強,exosomes濃度1.2g/l組次之,0.3g/l組與對照組無明顯差異(p0.05)不具濃度依賴性。0.6g/L exosomes組12h、24h時未見明顯差異(p0.05),36h時,共培養(yǎng)組MEF細胞指數(shù)(CI)高于對照組(p0.05),當(dāng)培養(yǎng)至48h時,共培養(yǎng)組CI值明顯高于對照組(p0.01)。共培養(yǎng)組MEF細胞MMP-2、MMP-9蛋白及mRNA表達高于對照組,E-cadherin蛋白及RNA表達低于對照組。MEF細胞的遷移力未見明顯變化(p0.05)。CFSE-exosomes與MEF細胞共培養(yǎng)6h后,在MEF細胞間可CFSE-exosomes的綠色熒光,偶見具有綠色熒光的MEF細胞。共培養(yǎng)12h后,可見部分MEF細胞內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光。共培養(yǎng)18h后,接近一半的MEF細胞內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光,共培養(yǎng)至48h時,幾乎所有的MEF細胞內(nèi)均可見綠色熒光。結(jié)論1.采用100000×g超速離心的方法可制備主要分布在90~430 nm,平均粒徑為169.7±4.62nm,具有脂質(zhì)雙分子膜并表達特征蛋白TSG101、TYRP2蛋白的exosomes。2.來自于B16-F10細胞的exosomes進入MEF細胞,誘導(dǎo)MEF細胞表達侵襲性表型,提示在惡性腫瘤細胞與正常細胞間可能存在腫瘤細胞向正常細胞傳遞侵襲性的exosomes通訊方式。
【關(guān)鍵詞】：Exosomes 黑素瘤細胞 小鼠胚胎成纖維細胞 侵襲性
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R739.5
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-15
• 參考文獻14-15
• 第一部分 B16-F10細胞exosomes的制備與鑒定15-24
• 1.材料與方法15-19
• 2 結(jié)果19-21
• 3 討論21-22
• 4 小結(jié)22-23
• 參考文獻23-24
• 第二部分 B16-F10細胞exosomes對小鼠胚胎成纖維細胞侵襲遷移性的影響24-46
• 第一章 MEF細胞與B16-F10細胞exosomes的融合25-32
• 1 材料與方法25-27
• 2 結(jié)果27-30
• 3 討論30
• 4 小結(jié)30-31
• 參考文獻31-32
• 第二章 B16-F10細胞exosomes對MEF細胞侵襲遷移力的影響32-46
• 1 材料與方法32-38
• 2 結(jié)果38-43
• 3 討論43-44
• 4 小結(jié)44-45
• 參考文獻45-46
• 全文總結(jié)46-47
• 文獻綜述47-55
• 參考文獻51-55
• 致謝55-56
• 碩士期間發(fā)表的文章56

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本文編號：984993