本文關鍵詞：MicroRNA-152對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖及膠原合成的影響

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【摘要】：研究背景及目的：瘢痕疙瘩是皮膚創(chuàng)傷愈合的過程中,成纖維細胞異常增殖、膠原過量沉積導致的纖維過度增生性疾病,臨床表現(xiàn)為超過原始皮損邊界、隆起于正常皮膚、常以蝶形或啞鈴形生長的良性腫塊。瘢痕疙瘩患者可有局部瘙癢、疼痛等癥狀,并可因搔抓、物理摩擦等因素導致感染,嚴重者可繼發(fā)潰瘍甚至發(fā)生瘢痕癌；若發(fā)生瘢痕攣縮則可能導致功能障礙。盡管瘢痕疙瘩為一種良性疾病,不發(fā)生遠處轉移,但因其嚴重影響美觀,且尚無單一有效的治療辦法能顯著改善其預后并減少復發(fā),對患者的生活質量和身心健康造成巨大損害。目前對瘢痕疙瘩的發(fā)病原因存在多種解釋,已知遺傳、基因調控、細胞因子、免疫等多種因素均與瘢痕疙瘩的發(fā)病過程密切相關,但具體的發(fā)病原因尚不清楚。因此,進一步探索瘢痕疙瘩的發(fā)病機制及尋找有效的治療辦法成為整形外科臨床醫(yī)生及科研工作者們亟待解決的問題。MicroRNA是一類非編碼小分子RNA,長度為22-25nt,在真核生物基因轉錄和／或翻譯水平具有廣泛的調控作用。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)microRNA參與了腫瘤、心血管疾病、皮膚纖維化及某些代謝病的發(fā)生發(fā)展,近年來研究發(fā)現(xiàn)microRNA還可以作為生物標記物及治療靶點而應用于臨床。目前,國內外關于microRNA在瘢痕疙瘩發(fā)生、發(fā)展中的作用及機制研究尚處于起步階段,相關研究主要集中于對瘢痕疙瘩組織或成纖維細胞中差異表達的microRNA的篩選。以往的研究發(fā)現(xiàn)microRNA-152在瘢痕疙瘩成纖維細胞中存在異常表達,但其在瘢痕疙瘩發(fā)生、發(fā)展中的具體作用尚不清楚。本研究擬通過在體外培養(yǎng)的人瘢痕疙瘩成纖維細胞中轉染microRNA-152擬似物實現(xiàn)microRNA-152的過表達,進一步研究microRNA-152對于瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖及膠原合成方面的作用,并探討可能的作用機制,以期從一定程度上解釋瘢痕疙瘩的發(fā)病機制,并為瘢痕疙瘩的治療提供理論依據。研究方法：收集手術切除的新鮮瘢痕疙瘩標本,體外培養(yǎng)人瘢痕疙瘩成纖維細胞,以脂質體2000轉染microRNA-152 mimics(擬似物),從而實現(xiàn)microRNA-152的過表達,應用實時熒光定量PCR法檢測瘢痕疙瘩成纖維細胞中microRNA-152的表達情況；利用CCK法檢測轉染后不同時期瘢痕疙瘩成纖維細胞的凋亡情況；利用羥脯氨酸比色法分析microRNA-152轉染對于瘢痕疙瘩成纖維細胞上清液中總膠原合成的影響；利用western blot分析瘢痕疙瘩成纖維細胞內Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的表達情況；并利用實時熒光定量PCR法檢測瘢痕疙瘩成纖維細胞Ⅰ型、Ⅲ型前膠原及TGF-β1 mRNA的水平。結果：在本研究中實驗組細胞成功轉染microRNA-152,與對照組相比實現(xiàn)了microRNA-152的過表達,實時熒光定量PCR法RQ值(3.658±0.026)vs.(1.016±0.031),p0.05；CCK法檢測發(fā)現(xiàn)與對照組相比,microRNA-152過表達組細胞增殖率升高,48h吸光值(0.699±0.031)vs.(0.588±0.0071),p0.05；72h吸光值(0.726±0.0095)vs.(0.633±0.011),p0.05；microRNA152過表達組上清液中膠原蛋白含量增加,與對照組相比羥脯氨酸含量(μg/ml)為(3.909±0.015) vs. (2.311±0.075), p0.05; Western blot檢測到microRNA-152過表達組瘢痕疙瘩成纖維細胞內Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的含量增加；RealTime PCR檢測到瘢痕疙瘩成纖維細胞中Ⅰ型、Ⅲ型前膠原基因(COL1A、COL3A1)及TGF β-1基因mRNA水平增加,RQ值分別為(1.75±0.019)vs.(1.063±0.017),p0.05；(1.356±0.074)vs.(1.045±0.061),p0.05；(2.12±0.03)vs.(1.08±0.033),p0.05。結論：研究首次證實了microRNA-152可以促進瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖及膠原蛋白合成。因此microRNA-152可能是瘢痕疙瘩發(fā)病中的重要分子之一,有望成為新的生物標記物及瘢痕疙瘩治療的潛在靶點。
【關鍵詞】：瘢痕疙瘩 成纖維細胞 microRNA-152 細胞增殖 膠原蛋白
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R751
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本文編號：967127