本文關鍵詞：IL-9在小鼠銀屑病皮損的表達及其抗體對IL-17、CCR6的影響研究

  更多相關文章： 銀屑病 白細胞介素-9 白細胞介素-9抗體 白細胞介素-17 CC趨化因子受體6

【摘要】：研究背景銀屑病是一種常見的慢性炎癥性疾病,銀屑病病程長、反復發(fā)作,目前尚無根治方法,給患者及家庭帶來巨大的經濟及精神壓力。銀屑病發(fā)病原因及發(fā)病機理尚未完全明確,多種因素如環(huán)境、精神神經、免疫、內分泌及遺傳因素等共同參與了其發(fā)病,自身免疫異常是其中的中心環(huán)節(jié)。近年來的研究表明銀屑病是一種Thl/Th17細胞介導的多種細胞因子參與的疾病,Th17細胞參與多種自身免疫疾病,如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關節(jié)炎、強直性脊柱炎等,在這些疾病中發(fā)揮了重要作用。銀屑病發(fā)病中以Th17細胞及其相關細胞因子如白介素(IL)-17、IL-22等占主導地位,IL-17轉基因小鼠表現(xiàn)出與人類銀屑病高度相似的病理表現(xiàn)。銀屑病皮損及血清中IL-17及IL-22蛋白含量及mRNA含量均升高,并與病情嚴重程度明顯相關,IL-17抗體用于治療小鼠銀屑病皮損也取得了顯著療效,紅斑、鱗屑、皮膚增厚等臨床癥狀的緩解伴隨著血清及皮損中IL-17等的含量下降,這些都說明了IL-17在銀屑病中的重要作用。IL-17通過多種途徑參與銀屑病的發(fā)�。捍龠M多種炎癥因子如干擾素(IFN)-γ、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-6、IL-9、IL-18、 IL-36、粒細胞-巨噬細胞刺激因子(GM-CSF)、抗菌肽等的產生,刺激角質形成細胞的增生反應以及局部炎癥的形成；刺激血管內皮生長因子(VEGF)的產生,促進毛細血管增生及局部血管擴張；通過促進各種趨化因子如IL-8、CC趨化因子配體(CCL)20、CC趨化因子受體(CCR)6的產生,吸引中性粒細胞、樹突狀細胞、淋巴細胞等向表皮的遷移,共同促進局部炎癥浸潤以及銀屑病樣皮損的產生。另外,Thl7細胞也分泌IL-22等細胞因子,通過直接作用于角質形成細胞,促進其增生,參與銀屑病的發(fā)生。Th17細胞向表皮靶向組織的遷移浸潤是銀屑病發(fā)病中最早的過程,CCR6表達于Th17細胞、樹突狀細胞等表面,參與其向表皮的遷移,CCL20是其特異性的配體,主要表達于角質形成細胞,研究表明銀屑病皮損CCL20、CCR6表達升高,表明銀屑病皮損中Th17細胞、樹突狀細胞等受到多種因子的作用,在CCL20-CCR6介導下,向表皮聚集、遷移增多。IL-17、CCR6的表達受多種因素調節(jié),如TNF-α、IFN-γ等,近來有研究表明IL-9對Th17通路及其相關因子如IL-17、CCR6等有調節(jié)作用。IL-9是一種單鏈糖蛋白,具有維持T淋巴細胞克隆、促進其生長分化的功能。研究表明銀屑病患者皮損IL-9水平增高,外周血Th9細胞比例及IL-9含量較正常人升高,提示IL-9與銀屑病的發(fā)病相關。IL-9最初被認為是一種Th2相關的細胞因子,既往研究集中于過敏性哮喘、寄生蟲感染、特應性皮炎等,在這些疾病中對肥大細胞、嗜酸性粒細胞、氣道上皮細胞等的生長分化、信號傳導及功能方面發(fā)揮起著重要的調節(jié)作用。在哮喘中IL-9通過信號傳導及轉錄激活因子(STAT)通路促進肥大細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞等炎癥細胞的分化、成熟與增殖；增強肥大細胞對于變應原的反應,促進氣道高反應性的產生；提高氣道上皮細胞分泌粘蛋白的量,提高杯狀細胞的比例；促進炎癥細胞分泌IgE、IL-13等。在對抗寄生蟲感染方面,IL-9可促進腸道嗜酸性粒細胞以及肥大細胞的增殖以及IgE、IgG的表達,刺激腸道肌肉收縮,從而加快寄生蟲從腸道的排除,增強機體對抗寄生蟲感染的能力。近年來發(fā)現(xiàn)Th9細胞、Th17細胞、調節(jié)性T細胞(Treg細胞)等也可以產生IL-9,體外實驗中IL-9對Th17細胞的分化有一定的調節(jié)功能,對于初始T細胞的分化及多種細胞因子如TNF-α、IFN-γ、IL-17等的分泌有重要作用。IL-9參與多種Th17相關自身免疫疾病,如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、實驗性自身免疫性腦脊髓炎、實驗性自身免疫性葡萄膜炎等,在這些疾病的血清、皮損或關節(jié)液、腦脊液中升高,并與病情嚴重程度相關。另外,研究發(fā)現(xiàn)在黑素瘤中IL-9可通過吸引CCR6+樹突狀細胞到局部腫瘤部位,發(fā)揮抗腫瘤作用。研究發(fā)現(xiàn)在實驗性自身免疫性腦脊髓炎中IL-9可以介導CCR6+Th17細胞向中樞的遷移,參與中樞神經系統(tǒng)炎癥的形成。應用IL-9抗體通過降低局部IL-17的水平及Thl7細胞的數(shù)量,緩解實驗性自身免疫性腦脊髓炎、實驗性自身免疫性葡萄膜炎的病情。以上研究表明IL-9對Th17細胞通路有調節(jié)作用,而銀屑病的發(fā)病中Th17細胞及其相關因子如IL-17、CCR6發(fā)揮了重要作用,因而探討IL-9在小鼠銀屑病皮損中的表達,初步研究IL-9及其抗體參與銀屑病的機理就顯得極為重要。本實驗用咪喹莫特誘導小鼠銀屑病模型,觀察IL-9在皮損中的表達,并對咪喹莫特銀屑病小鼠腹腔注射IL-9抗體,觀察是否對對銀屑病樣皮損有改善作用,并檢測檢測抗體應用前后局部IL-17、CCR6水平,觀察其相關性,初步探討IL-9抗體緩解銀屑病樣皮損的機制,為銀屑病的生物制劑治療增添新的思路。研究目的1.比較IL-9在咪喹莫特銀屑病小鼠皮損與在對照組小鼠皮膚中的表達。2.探討IL-9抗體對咪喹莫特小鼠銀屑病樣皮損是否具有緩解作用。3.探討IL-9抗體對銀屑病皮損IL-17與CCR6的影響,初步探討IL-9參與銀屑病發(fā)病的機制。研究方法1. BALB/c雌性小鼠背部涂抹咪喹莫特乳膏連續(xù)8天,建立小鼠銀屑病模型,并進行HE染色確定造模成功；對照組涂抹凡士林。2.通過免疫組織化學法檢測IL-9在咪喹莫特小鼠皮損及對照組小鼠皮膚中的表達并進行比較；3.將BALB/c雌性小鼠隨機分配為三組：凡士林空白對照組(簡稱空白對照組)、咪喹莫特模型組(簡稱模型組)以及IL-9抗體實驗組(簡稱實驗組)�？瞻讓φ战M：每日背部涂抹凡士林乳膏+隔日腹腔注射200微克PBS；模型組：每日背部涂抹咪喹莫特乳膏+隔日腹腔注射200微克PBS；實驗組：每日背部涂抹咪喹莫特乳膏+隔日腹腔注射200微克IL-9抗體；4.觀察三組小鼠皮損嚴重程度變化同時進行PASI評分,HE染色觀察病理變化,并測量皮損表皮層厚度,從宏觀上以及微觀層面比較IL-9抗體對小鼠銀屑病樣皮損的影響；5.三組小鼠背部皮損取材,每只小鼠皮膚分別予石蠟包埋與液氮冷凍。石蠟組織進行免疫組織化學法檢測皮損中IL-17、CCR6的變化,液氮冷凍組織進行Western Blot檢測皮損IL-17的表達,比較三組之間兩個指標表達的差異,探討IL-9抗體對小鼠皮損IL-17、CCR6含量的影響。結果1.IL-9在小鼠銀屑病皮損及正常小鼠皮膚中的表達免疫組織化學結果顯示IL-9在咪喹莫特小鼠銀屑病皮損中表達較對照組明顯升高(P0.05)。對照組小鼠僅表皮可見少量IL-9表達,呈淺棕色,而咪喹莫特小鼠皮損中表皮及真皮均可見IL-9表達,呈棕褐色、褐色,細胞著色數(shù)量顯著增多。結果提示IL-9可能參與了銀屑病咪喹莫特模型的建立。2.IL-9抗體對于小鼠銀屑病樣皮損的影響實驗發(fā)現(xiàn),模型組在涂抹咪喹莫特的第2天背部皮膚出現(xiàn)淡紅色斑,第3天出現(xiàn)紅斑、少許鱗屑,隨后皮膚逐漸出現(xiàn)褶皺、增厚,第4-6天紅斑、鱗屑持續(xù)增多,第7-8天各指標達峰值,呈典型的銀屑病樣的皮損改變。而實驗組同步注射IL-9抗體,第2天僅部分小鼠出現(xiàn)點狀紅斑,第3天部分小鼠背部皮膚為淡紅色,鱗屑較少,第4-8天紅斑、鱗屑、增厚緩慢加重,部分小鼠無加重,各指標均較同一時間模型組減輕,第7-8天未呈現(xiàn)典型銀屑病皮損。空白對照組小鼠背部皮膚始終保持正常。表明IL-9抗體在宏觀上對于咪喹莫特小鼠銀屑病樣皮損有緩解作用。HE染色顯示,第8天,模型組皮損呈銀屑病樣改變,表皮明顯增厚,可見角化過度、角化不全,棘層增厚明顯,表皮突延長,真皮乳頭可見血管增生擴張,皮下多見淋巴細胞浸潤。而實驗組表皮增厚、棘突肥厚、淋巴細胞浸潤等改變均低于模型組,空白對照組小鼠皮膚未見異常。表明IL-9抗體明顯改善咪喹莫特小鼠銀屑病皮損的病理嚴重程度。3.IL-9抗體對于小鼠銀屑病樣皮損IL-17及CCR6的影響免疫組化結果表明,空白組小鼠僅少量表達IL-17與CCR6,在真皮輕度顯色,呈淡褐色；模型組著色細胞層數(shù)及數(shù)量顯著增多,IL-17顯著染色,廣泛表達于表皮及真皮,呈深褐色、棕褐色顆粒,CCR6主要表達于表皮全層,呈褐色顆粒；實驗組著色細胞數(shù)量顯著低于模型組,IL-17、CCR6染色呈淺褐色,分布于真皮及表皮基底層。與空白對照組相比,模型組小鼠皮損中IL-17、CCR6的含量顯著增高(P0.05)；與模型組相比,實驗組小鼠的皮損嚴重程度明顯降低,炎癥細胞浸潤減輕,IL-17、CCR6表達亦明顯降低(P0.05)。而Western Blot也顯示實驗組與模型組皮損IL-17的差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。提示IL-9抗體明顯降低皮損局部IL-17及CCR6的表達。結論1. 與對照組小鼠皮膚相比,IL-9在咪喹莫特銀屑病小鼠皮損中表達升高,提示IL-9可能參與銀屑病的發(fā)病。2.IL-9抗體可改善咪喹莫特小鼠銀屑病樣皮損的紅斑、鱗屑、增厚情況,該作用可能與其抑制CCR6的表達,減少皮損中Th17細胞及樹突狀細胞的數(shù)目,以及抑制局部皮膚IL-17的含量有關。
【關鍵詞】：銀屑病 白細胞介素-9 白細胞介素-9抗體 白細胞介素-17 CC趨化因子受體6
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R758.63
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-18
• 前言18-28
• 1 銀屑病的發(fā)病機制以及IL-17、CCR6在發(fā)病中的作用18-22
• 2 銀屑病的生物制劑治療22-23
• 3 IL-9及其抗體在免疫性疾病中的研究23-28
• 第一章 IL-9在咪喹莫特小鼠銀屑病皮損的表達28-44
• 1 研究背景及目的28-29
• 2 材料29-30
• 2.1 實驗試劑29
• 2.2 實驗儀器及設備29-30
• 2.3 實驗動物30
• 3 方法30-36
• 3.1 主要溶液的配置30-31
• 3.2 咪喹莫特小鼠銀屑病模型的建立31
• 3.3 銀屑病皮損評分31-33
• 3.4 小鼠背部皮膚HE染色33-34
• 3.5 免疫組織化學檢查34-36
• 3.6 數(shù)據(jù)分析36
• 4 結果36-39
• 4.1 小鼠銀屑病模型的建立36-39
• 4.2 IL-9在咪喹莫特小鼠銀屑病模型的表達39
• 5 討論39-44
• 5.1 模型構建的評價39-42
• 5.2 實驗結果評價42-44
• 第二章 IL-9抗體對小鼠銀屑病樣皮損以及IL-17、CCR6的影響44-58
• 1 研究背景及目的44-45
• 2 材料45-46
• 2.1 實驗試劑45
• 2.2 實驗儀器及設備45-46
• 2.3 實驗動物46
• 3 方法46-49
• 3.1 主要溶液的配置同前所述46
• 3.2 咪喹莫特小鼠銀屑病模型的建立及處理46-47
• 3.3 銀屑病皮損評分同前所述47
• 3.4 小鼠背部皮膚HE染色同前所述47
• 3.5 免疫組織化學檢查47
• 3.6 Western Blot47-49
• 3.7 數(shù)據(jù)分析49
• 4 結果49-54
• 4.1 IL-9抗體對小鼠銀屑病樣皮損的影響49-51
• 4.2 IL-9抗體對小鼠銀屑病樣皮損IL-17及CCR6的影響51-54
• 5 討論54-58
• 5.1 IL-9抗體對于小鼠銀屑病樣皮損具有緩解作用54-55
• 5.2 IL-9抗體緩解銀屑病樣皮損與降低局部IL-17、CCR6的含量55-58
• 全文總結58-59
• 附錄59-61
• 參考文獻61-68
• 成果68-69
• 致謝69-71

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