本文關(guān)鍵詞：TNIP1蛋白在銀屑病發(fā)病中的作用及機(jī)制研究

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【摘要】：背景：尋常型銀屑病(以下簡(jiǎn)稱銀屑病)臨床常見、多發(fā),病程慢性易反復(fù),影響1-2%的歐洲和北美人群；中國(guó)人群患病率僅為0.47%,但人口基數(shù)大,仍有著相對(duì)龐大的人群受累。銀屑病主要累及皮膚,表現(xiàn)為鱗屑、紅斑、斑塊,多伴瘙癢。與大部分皮膚病不同的是,銀屑病患者伴發(fā)代謝綜合征如血脂紊亂、高血壓、心血管疾病等疾病的發(fā)病率高于正常人群。其具體發(fā)病機(jī)制不清,臨床治療手段有限,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,并給社會(huì)和患者家庭帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。家族聚集性研究(familial aggregaltion studies)證實(shí)銀屑病會(huì)遺傳,這是一個(gè)多基因遺傳疾病,其發(fā)病模式不符合任何孟德爾遺傳規(guī)律；我國(guó)流行病學(xué)調(diào)查資料顯示28.43%的銀屑病患者有家族史,遠(yuǎn)高于普通人群的2.23%。目前普遍認(rèn)為銀屑病是有基因易感性的個(gè)體在環(huán)境因素的影響下發(fā)展出來(lái)的炎癥性皮膚病。近年來(lái),隨著全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association studies,GWAS)技術(shù)的大力開展,至少有36個(gè)不同的基因被先后鑒定為銀屑病的易基因,而其中少數(shù)基因,如白介素-23(interleukin 23,IL-23)基因、IL-23受體(IL-23 receptor,IL-23R)基因和腫瘤壞死因子a誘導(dǎo)蛋白3的相互作用蛋白1(TNIP1)基因已經(jīng)在多種族人群包括中國(guó)人群中被證實(shí)為銀屑病的易感基因。對(duì)IL-23/IL-23R編碼的細(xì)胞因子IL-23及其受體的研究,引出了一類特殊的T輔助細(xì)胞17(T helper 17,Th17)的發(fā)現(xiàn)和命名。Thl7細(xì)胞以分泌細(xì)胞因子IL-17為重要特征。勿庸置疑,目前以拮抗IL-17為主的生物制劑因其作用顯著、副作用小為銀屑病的治療帶來(lái)巨大變化,這充分說(shuō)明致力于銀屑病易感基因的生物學(xué)研究,對(duì)延伸GWAS的研究成果、解讀銀屑病發(fā)病機(jī)制、篩選新的銀屑病生物治療靶點(diǎn)均意義重大。TNIP1基因,作為中國(guó)漢族和歐洲人群所共有的另一個(gè)銀屑病易感基因,其表達(dá)水平在銀屑病皮損處比未受累皮膚和正常人皮膚均顯著升高；除了銀屑病,TNIP1亦被GWAS證實(shí)為系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE).肺癌和系統(tǒng)性硬化病(systemic sclerosis)等疾病的易感基因。TNIP1基因編碼的TNIP1蛋白,與TNIP2.TNIP3同屬于TNIPs家族,該家族因能與泛素編輯蛋白A20結(jié)合、并抑制核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor-κB, NF-κB)的轉(zhuǎn)錄活性而得名,并因此獲得另一個(gè)命名ABINs(A20-binding inhibitor of NF-κB)。目前已經(jīng)證實(shí)TNIP1可不依賴于A20和NF-κB發(fā)揮作用,細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinasel/2, Erk1/2)、視黃酸受體-α/-γ (retinoic acid receptor-α/-γ, RAR-α/-γ)、過(guò)氧化物酶體增殖體激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors, PPARs)和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白p(CCAAT/enhancer-binding protein β, C/EBPβ)等均被證實(shí)為TNIP1的靶目標(biāo),這些分子被TNIP1激活后可通過(guò)多條迥異的信號(hào)通路發(fā)揮不同的生物作用。目前關(guān)于RAR-α與TNIP1的研究較多。研究發(fā)現(xiàn),TNIP1與RAR-α共存于人類頭皮表皮細(xì)胞的同一亞細(xì)胞小室(subcellular compartment)中,這種共存模式為TNIP1/RAR-α相互作用提供了生理基礎(chǔ)。在RAR-α被相應(yīng)配體激活后,TNIP1作為RAR-α的協(xié)同抑制因子(corepressor)發(fā)揮相應(yīng)的作用。因此,TNIP1被歸屬為與激動(dòng)劑結(jié)合的核受體(nuclear receptor, NR)的協(xié)同抑制因子；而另一個(gè)NR的協(xié)同抑制因子,PRAME,已被證實(shí)與惡性腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物維甲酸的敏感性有關(guān)。TNIP1是否與腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性有關(guān),目前并無(wú)相關(guān)報(bào)道。除了皮膚,TNIP1蛋白還廣泛分布于多種器官／組織和細(xì)胞中,如腦組織、心臟、肺、胃、腎臟、前列腺、胰腺、結(jié)腸等多種組織／器官均可見TNIP1蛋白表達(dá)。TNIP1主要表達(dá)于細(xì)胞胞漿,但在上皮細(xì)胞包括表皮細(xì)胞中,可同時(shí)見TNIP1的胞核分布和胞漿分布。TNIP1在上皮細(xì)胞胞核和胞漿之間的轉(zhuǎn)移,被認(rèn)為參與了RAR受體和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor α, TNFα)受體信號(hào)通路。有意思的是,即使同為上皮組織起源,TNIP1蛋白在皮膚鱗癌(squamous cell carcinoma, SCC)的表達(dá)水平較正常組織顯著升高,而前列腺腺癌組織TNIP1蛋白則顯著丟失,提示TNIP1在不同組織起源的腫瘤組織中發(fā)揮不同甚至相反的作用。綜上,我們有理由相信對(duì)TNIP1基因及其編碼蛋白TNIP1在皮損局部的生物學(xué)作用進(jìn)行研究可能會(huì)推動(dòng)銀屑病發(fā)病機(jī)制研究的進(jìn)展。角質(zhì)形成細(xì)胞作為表皮數(shù)量最多的優(yōu)勢(shì)細(xì)胞,在以角質(zhì)形成細(xì)胞增殖分化異常為主要特征之一的銀屑病相關(guān)研究中,一直占有重要地位。過(guò)度增殖的角質(zhì)形成細(xì)胞可產(chǎn)生過(guò)量的抗菌肽(antimicrobial peptides and proteins, AMPs),其中cathelicidin/LL-37、β-defensins和S100蛋白被認(rèn)為在銀屑病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。此外,AMPs被認(rèn)為參與了銀屑病皮損處的多種免疫反應(yīng),比如化學(xué)趨化因子、血管生成因子的合成；AMPs亦參與調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖。角質(zhì)形成細(xì)胞顯著異常,致銀屑病表皮屏障功能嚴(yán)重受損,亦被認(rèn)為參與了銀屑病的發(fā)病過(guò)程。而2005年研究者們將小鼠表皮基底層細(xì)胞Jun蛋白敲除繼而阻斷轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1 (transcription factorActivator Protein 1, AP-1)信號(hào)通路后,在小鼠皮膚上成功誘導(dǎo)出類似人類銀屑病臨床表現(xiàn)的皮膚炎癥和關(guān)節(jié)炎,更是將角質(zhì)形成細(xì)胞在銀屑病致病機(jī)制中的作用推到了高處。人類JunB(19p13.2)是AP-1轉(zhuǎn)錄因子的組成成分之一,位于銀屑病易感位點(diǎn)6(PSORS6)的位點(diǎn)(19p13)處；JunB蛋白表達(dá)于多種器官中,主要參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡過(guò)程和調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的合成。因此我們推測(cè),以角質(zhì)形成細(xì)胞為銀屑病致病機(jī)制的研究對(duì)象,以細(xì)胞增殖、分化為研究的切入點(diǎn)是可行的。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模阂訲NIP1調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖為切入點(diǎn)探討銀屑病易感基因TNIP1在銀屑病發(fā)病機(jī)制中可能的生物學(xué)作用以及機(jī)制研究。實(shí)驗(yàn)方法：(1)應(yīng)用免疫組化(immunohistochemistry, IHC)、免疫印跡和實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR)檢測(cè)銀屑病表皮TNIP1蛋白和基因水平；(2)應(yīng)用免疫熒光結(jié)合激光共聚焦檢測(cè)HaCaT細(xì)胞內(nèi)源性TNIP1蛋白表達(dá)情況,并檢測(cè)自行分離培養(yǎng)的人原代角質(zhì)形成細(xì)胞(primary human keratinocyte, PHK)全角蛋白AE1/AE3的表達(dá)情況；(3)設(shè)計(jì)、合成特異性抗TNIP1短發(fā)夾干擾RNA (small interfering hairpin RNA, shRNA)TNIP1 shRNA和重組TNIP1(recombinant TNIP1, rTNIP1),并以慢病毒為載體,分別感染角質(zhì)形成細(xì)胞和BALB/c小鼠；(4)應(yīng)用qRT-PCR和免疫印跡分別檢測(cè)TNIP1 shRNA HaCaT/PHK細(xì)胞和rTNIP1 HaCaT/PHK細(xì)胞的TNIP1 mRNA水平和TNIP1蛋白水平；(5)應(yīng)用活體小動(dòng)物成像、免疫印跡分別檢測(cè)BALB/c小鼠感染慢病毒后熒光表達(dá)情況和TNIP1蛋白水平,并用免疫組化檢測(cè)局部IκBα、IL-lb、TNF-α和IL-1a等細(xì)胞因子表達(dá)水平；(6)應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8, CCK8)=ELISA BrdU和免疫印跡檢測(cè)細(xì)胞角蛋白6 (cytokeratin 6, CK6)水平分別評(píng)價(jià)角質(zhì)形成細(xì)胞感染慢病毒后的增殖能力；(7)應(yīng)用免疫印跡檢測(cè)慢病毒感染角質(zhì)形成細(xì)胞的Erk1/2水平和磷酸化Erk1/2 (phosphorylation of Erkl/2, p-Erkl/2)水平,并用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation, Co-IP)研究在HaCaT細(xì)胞TNIP1是否與Erk1/2相互作用,(8)應(yīng)用Erk1/2特異性抑制劑抑制Erk1/2磷酸化,再用免疫印跡檢測(cè)慢病毒細(xì)胞的CK6蛋白水平；(9)應(yīng)用免疫印跡檢測(cè)慢病毒感染角質(zhì)形成細(xì)胞的C/EBPβ水平；(10)構(gòu)建、合成抗C/EBPβ的特異性小干擾RNA (small interfering RNA, siRNA),以抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的C/EBPβ水平,并用免疫印跡檢測(cè)細(xì)胞的CK6蛋白水平；(11)采用咪喹莫特(imiquimod, IMQ)-誘導(dǎo)BALB/c小鼠銀屑病樣皮炎動(dòng)物模型,對(duì)小鼠背部涂抹區(qū)域的紅斑、鱗屑和皮膚粗糙、隆起情況進(jìn)行評(píng)分、統(tǒng)計(jì)分析,并行皮膚組織組織病理檢查,觀察局部炎細(xì)胞浸潤(rùn)和角質(zhì)形成細(xì)胞增殖情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：(1)銀屑病皮損表皮與正常皮膚比較,其TNIP1基因水平、CK6基因水平顯著升局；TNIP1蛋白表達(dá)顯著降低,而CK6蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)。TNIP1蛋白水平降低可能參與了銀屑病的發(fā)病。皮內(nèi)注射慢病毒下調(diào)小鼠局部皮膚TNIP1蛋白水平后,會(huì)加劇IMQ誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮炎臨床表現(xiàn)(紅斑、鱗屑、皮膚隆起評(píng)分及總評(píng)分)提示TNIP1對(duì)銀屑病樣皮炎有保護(hù)作用；(2)通過(guò)檢測(cè)CK6基因/蛋白水平、CCK8增殖實(shí)驗(yàn)、ELISA BrdU實(shí)驗(yàn),一致證實(shí)HaCaT/PHK細(xì)胞增殖受TNIP1蛋白水平變化的調(diào)節(jié)。下調(diào)TNIP1表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞增殖增強(qiáng),而上調(diào)TNIP1則抑制細(xì)胞增殖；(3)免疫共沉淀Co-IP證實(shí)HaCaT細(xì)胞TNIP1與Erk2相互作用。角質(zhì)形成細(xì)胞的TNIP1水平上調(diào)后,其p-Erk1/2和C/EBPβ表達(dá)被抑制；TNIP1表達(dá)下調(diào)則導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞的p-Erk1/2和C/EBPβ表達(dá)增強(qiáng)。推測(cè)TNIP1可能通過(guò)Erk1/2和C/EBPβ調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖。在TNIP1水平下調(diào)的前提下,分別抑制TNIP1 shRNA HaCaT細(xì)胞的p-Erk1/2或C/EBPβ水平后,會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞CK6蛋白水平降低,推測(cè)TNIP1部分通過(guò)p-Erkl/2或C/EBPβ來(lái)調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖能力(CK6表達(dá)水平)。結(jié)論：銀屑病患者皮損處表皮的TNIP1蛋白水平降低,而mRNA水平升高。下調(diào)小鼠皮膚局部TNIP1蛋白水平,會(huì)加劇IMQ誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮炎表現(xiàn),提示TNIP1對(duì)銀屑病有保護(hù)作用。在體外TNIP1蛋白水平下調(diào)后會(huì)促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖,反之,則抑制增殖。推測(cè)TNIP1可能通過(guò)調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖參與銀屑病致病。我們的研究顯示TNIP1有望成為銀屑病治療的生物治療靶點(diǎn)之一。
【關(guān)鍵詞】：銀屑病 TNIP1-角質(zhì)形成細(xì)胞 增殖 角蛋白CK6 Erk1/2 C/EBPβ 短發(fā)夾干擾RNA 小干擾RNA 慢病毒載體 咪喹莫特
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R758.63
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-6
• Abstract6-13
• 摘要13-18
• 第一章 前言18-24
• 第二章 TNIP1特異性短發(fā)夾干擾RNA慢病毒載體(TNIP1 shRNA)和重組TNIP1(rTNIP1)慢病毒載體的構(gòu)建、擴(kuò)增及體內(nèi)外轉(zhuǎn)染24-57
• 2.1 材料與方法25-44
• 2.2 結(jié)果44-51
• 2.3 討論51-55
• 2.4 小結(jié)55-57
• 第三章 TNIP1調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖及機(jī)制研究57-74
• 3.1 材料與方法57-63
• 3.2 結(jié)果63-70
• 3.3 討論70-72
• 3.4 小結(jié)72-74
• 第四章 TNIP1對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮炎影響74-80
• 4.1 材料與方法74-76
• 4.2 結(jié)果76-77
• 4.3 討論77-79
• 4.4 小結(jié)79-80
• 全文總結(jié)80-81
• 參考文獻(xiàn)81-87
• 文獻(xiàn)綜述 銀屑病免疫發(fā)病機(jī)制研究及生物治療進(jìn)展87-99
• 參考文獻(xiàn)96-99
• 攻讀博士學(xué)位期間已經(jīng)發(fā)表的論文99-100
• 致謝100-101

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 陳艷;TNIP1蛋白在銀屑病發(fā)病中的作用及機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：950725