發(fā)布時間：2017-09-20 23:31

  本文關(guān)鍵詞：IGF-Ⅰ、醛固酮對成纖維細(xì)胞的作用及對彈性蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)及其機制探討

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【摘要】：成纖維細(xì)胞是皮膚真皮中的主體細(xì)胞成分,在皮膚老化過程中扮演著重要的角色。成纖維細(xì)胞合成彈性蛋白減少、彈性纖維減少、卷曲,使皮膚彈性下降、松弛,出現(xiàn)皺紋。目的:本課題著眼于與皮膚衰老密切相關(guān)的皮膚成纖維細(xì)胞,研究IGF-I、醛固酮對皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響,同時通過研究IGF-I、醛固酮對皮膚彈性蛋白的合成的影響,探討醛固酮發(fā)揮作用的途徑,觀察醛固酮對IGF-I信號通路的影響、作用靶點,并探討其可能機制。方法:1.MTT法檢測不同時間不同濃度IGF-I對皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響,分為調(diào)零組、對照組、50ng/ml IGF-I、100ng/ml IGF-I、200ng/ml IGF-I、500ng/ml IGF-I組,連續(xù)觀察12h,24h,48h,72h,96h。2.MTT法檢測不同時間不同濃度醛固酮對皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響:調(diào)零組、對照組、10nmol/L醛固酮、50nmol/L醛固酮、1μmol/L醛固酮組,連續(xù)觀察12h,24h,48h,72h,96h。3.免疫熒光法檢測不同濃度IGF-I對彈性蛋白的調(diào)節(jié):制作細(xì)胞爬片,按照50ng/ml IGF-I、100ng/ml IGF-I、200ng/ml IGF-I、500ng/ml IGF-I濃度梯度加藥,并設(shè)陰性對照。4.免疫熒光法檢測不同濃度醛固酮對彈性蛋白的調(diào)節(jié):按照10nmol/L醛固酮、50nmol/L醛固酮、1μmol/L醛固酮濃度梯度加藥,并設(shè)陰性對照。5.免疫熒光法檢測醛固酮對彈性蛋白調(diào)節(jié)機理的探討:根據(jù)實驗結(jié)果篩選出最佳濃度醛固酮,分別與最佳濃度IGF-I、極量IGF-I以結(jié)合全部IGF-I受體、醛固酮受體拮抗劑安體舒通共同孵育細(xì)胞,并設(shè)陰性對照。酪氨酸酶抑制劑分別與最佳濃度的醛固酮、IGF-I作用于細(xì)胞,磷脂酰基醇抑制劑分別與最佳濃度的醛固酮、IGF-I作用于細(xì)胞,并設(shè)陰性對照,細(xì)胞免疫熒光及共聚焦觀察彈性蛋白的變化。7.Western blot半定量檢測醛固酮對彈性蛋白調(diào)節(jié)機理的探討,進(jìn)一步印證免疫熒光的結(jié)果。結(jié)果:1.MTT法檢測不同時間不同濃度IGF-I對皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響:與對照組相比50ng/ml IGF-I、100ng/ml IGF-I與200ng/ml IGF-I組有明顯差異,大于對照組,P0.05;與50ng/ml IGF-I比較100ng/ml IGF-I與200ng/ml IGF-I組有明顯差異,大于該組,P0.05;100ng/ml IGF-I與200ng/ml IGF-I組間無明顯差異。與對照組比較500ng/ml IGF-I組有明顯差異,小于對照組,P0.05。2.MTT法檢測不同時間不同濃度醛固酮對皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響:與對照組相比各時間段50nmol/L醛固酮組及12h、96h10nmol/L醛固酮組有明顯差異,大于對照組,P0.05;各時間段50nmol/L醛固酮組與10nmol/L醛固酮比較有明顯差異,大于該組,P0.05。1μmol/L醛固酮組與對照組比較有明顯差異,小于對照組,P0.05。3.免疫熒光法檢測不同濃度IGF-I對彈性蛋白的調(diào)節(jié):50ng/ml IGF-I組、100ng/ml IGF-I組、200ng/ml IGF-I組、與空白對照組比較,隨著IGF-I濃度的增加,成纖維細(xì)胞內(nèi)彈性蛋白的比例逐漸增加,100ng/ml IGF-I組、200ng/ml IGF-I組為最佳濃度組,500ng/ml IGF-I組與空白對照相比較,比例下降。4.免疫熒光法檢測不同濃度醛固酮對彈性蛋白的調(diào)節(jié):10nmol/L醛固酮組、50nmol/L醛固酮組、并與空白對照組比較,發(fā)現(xiàn)隨著醛固酮濃度的增加,成纖維細(xì)胞內(nèi)彈性蛋白的比例逐漸增加,50nmol/L醛固酮組為最佳濃度。1μmol/L醛固酮組與空白對照相比較,未見明顯變化。5.免疫熒光法、Western Blot法檢檢測醛固酮對彈性蛋白調(diào)節(jié)機理的探討發(fā)現(xiàn):與50nmol/L醛固酮組相比,50nmol/L醛固酮+安體舒通2um/ml組、50nmol/L醛固酮+100ng/ml IGF-I成纖維細(xì)胞內(nèi)彈性蛋白的比例增加,50nmol/L醛固酮+1000ng/ml IGF-I組成纖維細(xì)胞內(nèi)彈性蛋白的比例降低,各組成纖維細(xì)胞內(nèi)彈性蛋白的比例均高于空白細(xì)胞組。與空白對照相比,100ng/ml IGF-I+酪氨酸激酶抑制劑組比例增加,余醛固酮50nmol/L+酪氨酸激酶抑制劑1umol/L組、醛固酮50nmol/L+磷脂�；家种苿�1umol/L組、100ng/ml IGF-I+磷脂�；家种苿�1umol/L組未見明顯變化。100ng/ml IGF-I+酪氨酸激酶抑制劑PP210umol/L共同孵育細(xì)胞,彈性蛋白的量增多;50nmol/L醛固酮+1000ng/ml IGF-I組、醛固酮50nmol/L+酪氨酸激酶抑制劑1umol/L組、醛固酮50nmol/L+磷脂�；家种苿�1umol/L組、100ng/ml IGF-I+磷脂�；家种苿�1umol/L組彈性蛋白的未見明顯變化。結(jié)論:1.IGF-I在50ng/ml-200ng/ml濃度范圍內(nèi)與皮膚成纖維細(xì)胞的增生呈劑量效應(yīng)關(guān)系,且在100ng/ml-200ng/ml濃度時促進(jìn)增生作用顯著。高濃度IGF-I對細(xì)胞增殖有抑制作用。2.50nmol/L醛固酮組促皮膚成纖維細(xì)胞增生作用最顯著,高濃度醛固酮1μmol/L對細(xì)胞增殖有抑制作用。3.IGF-I在50ng/ml-200ng/ml濃度范圍內(nèi)隨著濃度增加,能有效促進(jìn)成纖維細(xì)胞彈性蛋白的合成,最佳濃度為100ng/ml-200ng/ml IGF-I;高濃度IGF-I(500ng/ml)有抑制成纖維細(xì)胞產(chǎn)生彈性蛋白的作用。4.醛固酮能增加彈性蛋白的合成呈劑量依賴性(最佳濃度為50nmol/L),醛固酮受體抑制劑安體舒通不能消除此作用,提示其發(fā)揮作用是通過非醛固酮受體依賴的途徑。5.醛固酮能明顯增加IGF-I受體酪氨酸磷酸化,而且IGF-I受體酪氨酸激酶抑制劑可以抑制醛固酮誘導(dǎo)的彈性蛋白的合成。因此推斷醛固酮促進(jìn)彈性蛋白合成是通過一個非醛固酮受體依賴性通路即IGF-I受體信號通路來完成。6.磷脂酰基醇抑制劑可以消除醛固酮及IGF-I對彈性蛋白的影響,提示醛固酮對彈性蛋白的影響不是通過醛固酮受體發(fā)揮作用,而是通過活化IGF-I受體,從而導(dǎo)致下游的PI3激酶/AKT信號系統(tǒng)來完成。由于類固醇激素很容易滲透皮膚,當(dāng)外用時類固醇透入皮膚,并刺激彈性蛋白的合成對延緩皮膚衰老提供一個新思路。
【關(guān)鍵詞】：成纖維細(xì)胞 彈性蛋白 醛固酮 IGF-I 細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R751
【目錄】：

• 中文摘要3-6
• Abstract6-10
• 縮略語/符號說明10-13
• 前言13-20
• 研究現(xiàn)狀、成果13-18
• 研究目的、方法18-20
• 一、IGF-Ⅰ、醛固酮對成纖維細(xì)胞的作用20-36
• 1.1 對象和方法20-27
• 1.1.1 材料20-22
• 1.1.2 皮膚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)22-25
• 1.1.3 MTT法檢測不同濃度IGF-Ⅰ對皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響25-26
• 1.1.4 MTT法檢測不同濃度醛固酮對皮膚成纖維細(xì)胞的影響26-27
• 1.1.5 統(tǒng)計學(xué)處理27
• 1.2 結(jié)果27-33
• 1.2.1 皮膚成纖維細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察27
• 1.2.2 MTT法檢測不同濃度IGF-Ⅰ對皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響27-31
• 1.2.3 MTT法檢測不同濃度醛固酮對皮膚成纖維細(xì)胞的影響31-33
• 1.3 討論33-34
• 1.4 小結(jié)34-36
• 二、免疫熒光法檢測IGF-Ⅰ、醛固酮對彈性蛋白的調(diào)節(jié)36-43
• 2.1 材料與方法36-37
• 2.1.1 主要試劑與物品36
• 2.1.2 操作步驟36-37
• 2.2 結(jié)果37-41
• 2.2.1 免疫熒光法檢測不同濃度IGF-Ⅰ對彈性蛋白的調(diào)節(jié)37-40
• 2.2.2 免疫熒光法檢測不同濃度醛固酮對彈性蛋白的調(diào)節(jié)40-41
• 2.3 討論41-43
• 三、免疫熒光法檢測醛固酮對彈性蛋白調(diào)節(jié)機理的探討43-51
• 3.1 細(xì)胞干預(yù)及處理43
• 3.2 細(xì)胞免疫熒光及共聚焦觀察43-44
• 3.3 結(jié)果44-49
• 3.3.1 醛固酮對彈性蛋白調(diào)節(jié)機理的探討 144-46
• 3.3.2 醛固酮對彈性蛋白調(diào)節(jié)機理的探討 246-49
• 3.4 討論49-51
• 3.4.1 免疫熒光方法注意點49
• 3.4.2 免疫熒光法檢測醛固酮對彈性蛋白調(diào)節(jié)機理的探討發(fā)現(xiàn)49-51
• 四、Western-blot法檢測IGF-Ⅰ、醛固酮對彈性蛋白的調(diào)節(jié)51-64
• 4.1 材料與方法51-55
• 4.1.1 主要試劑與物品51-55
• 4.2 細(xì)胞干預(yù)及處理55
• 4.3 樣品收集55-56
• 4.4 Western bloting檢測56-59
• 4.4.1 配膠56-57
• 4.4.2 SDS-PAGE電泳57
• 4.4.3 轉(zhuǎn)膜57-58
• 4.4.4 封閉及雜交58
• 4.4.5 化學(xué)發(fā)光，顯影及定影58-59
• 4.5 結(jié)果59-61
• 4.5.1 Western法檢測不同濃度IGF-Ⅰ、醛固酮對彈性蛋白的調(diào)節(jié)59-60
• 4.5.2 IGF-Ⅰ、醛固酮對彈性蛋白調(diào)節(jié)機制的探討60-61
• 4.6 討論61-64
• 4.6.1 Western-blot免疫印跡法注意點61-62
• 4.6.2 Western-blot方法檢測醛固酮對彈性蛋白調(diào)節(jié)機理的探討發(fā)現(xiàn)62-64
• 全文結(jié)論64-67
• 論文創(chuàng)新點67-68
• 參考文獻(xiàn)68-79
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明79-81
• 綜述181-93
• 綜述參考文獻(xiàn)89-93
• 綜述293-100
• 綜述參考文獻(xiàn)97-100
• 致謝100

【共引文獻(xiàn)】

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 左宗寶;大鼠脂肪源干細(xì)胞注射移植對皮膚組織自然衰老的影響[D];華中科技大學(xué);2014年

2 王春茂;血管緊張素Ⅱ調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2的表達(dá)在升主動脈瘤發(fā)病中的機制研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2015年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 高巖;血清趨化素在慢性心衰患者中的變化及螺內(nèi)酯的干預(yù)治療[D];河北醫(yī)科大學(xué);2013年

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本文編號：891069