本文關(guān)鍵詞：NOTCH信號通路調(diào)控細(xì)胞衰老在黑素細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和黑素瘤治療中的機(jī)制研究

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【摘要】：背景黑素瘤是源自黑素細(xì)胞的惡性腫瘤,雖然其發(fā)生率僅占皮膚腫瘤病例的5%左右,但因其增殖快、易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)等特點(diǎn),具有很高的致死率,居皮膚腫瘤致死原因的首位(占所有死亡病例的75%)。黑素瘤在我國每年的新發(fā)病例約2萬例,并且其發(fā)病率正在快速增長。然而,黑素瘤的診斷和治療目前仍面臨著許多挑戰(zhàn):黑素瘤發(fā)病因素十分復(fù)雜,多種誘因?qū)е碌幕蛲蛔兗靶盘柾樊惓６紖⑴c其中,因此明確特異而關(guān)鍵的致病分子事件相當(dāng)困難;在現(xiàn)有治療方案中,癌基因靶向藥物在治療初期獲得了良好的反應(yīng)率,給BRAF突變型的黑素瘤病例帶來新的曙光,但絕大多數(shù)病例均無可避免地出現(xiàn)治療抵抗,因此,如何克服癌基因靶向治療抵抗是目前黑素瘤臨床治療的一個難題。據(jù)統(tǒng)計,42%的黑素瘤源于黑素細(xì)胞良性皮損,如黑素細(xì)胞痣。黑素瘤發(fā)病學(xué)說中經(jīng)典的“細(xì)胞衰老逃逸”理論認(rèn)為:癌基因突變(如BRAFV600E及NRASQ61R)首先引起黑素細(xì)胞的短暫增殖,但在正常情況下,抑癌通路p53/p21或p16/p RB出現(xiàn)反應(yīng)性激活,通過阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程,將細(xì)胞誘導(dǎo)至穩(wěn)定的衰老狀態(tài),形成黑素細(xì)胞痣;但在少數(shù)情況下,個別獲得了額外的基因突變或表觀遺傳學(xué)改變的細(xì)胞克隆,可以克服抑癌通路的調(diào)控,逃逸細(xì)胞衰老屏障的限制,發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化,進(jìn)而發(fā)展為黑素瘤,但目前引起衰老逃逸的分子事件尚未完全明確。在發(fā)展為黑素瘤的細(xì)胞中,癌基因BRAF的活性突變是目前已知發(fā)生率最高的致癌突變,可引起下游MAPK等信號通路的持續(xù)激活,增強(qiáng)黑素瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力,并參與抗凋亡及促進(jìn)腫瘤血管生成等惡性行為。因此,靶向BRAF的抑制劑成為治療BRAF突變型黑素瘤病例的理想方法,的確,在臨床應(yīng)用的初期,BRAF靶向抑制劑威羅菲尼產(chǎn)生了良好的效果,治療總反應(yīng)率達(dá)到了53%,但在數(shù)月的治療“蜜月期”過后,幾乎所有病例的治療反應(yīng)率都出現(xiàn)下降,逐漸形成對威羅菲尼的治療抵抗,繼而出現(xiàn)黑素瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致治療失敗并造成病人死亡。因此,威羅菲尼的治療抵抗是目前黑素瘤臨床治療的一個難題。近年來,NOTCH通路在黑素瘤中的異�；罨捌涔δ苁艿綇V泛關(guān)注。NOTCH通路受體NOTCH1、NOTCH2以及主要配體Jagged1、Jagged2、DLL1在黑素瘤中的表達(dá)明顯高于黑素細(xì)胞痣;激活NOTCH1信號引起正常人黑素細(xì)胞出現(xiàn)類似黑素瘤細(xì)胞的惡性表型。這些結(jié)果都提示NOTCH通路在黑素瘤發(fā)生發(fā)展中的作用重要且復(fù)雜,因此,對其深入的探索十分必要。新近研究發(fā)現(xiàn),活化的NOTCH通路可以通過增加靶基因HES1的轉(zhuǎn)錄阻滯成纖維細(xì)胞的細(xì)胞衰老進(jìn)程,促進(jìn)細(xì)胞衰老逃逸的發(fā)生。然而,在黑素瘤的發(fā)生發(fā)展過程中,NOTCH通路對細(xì)胞衰老的調(diào)控作用仍知之甚少。因此,全面了解NOTCH通路在黑素細(xì)胞惡變過程的關(guān)鍵步驟之一——衰老逃逸中的作用具有重要意義。此外,新近研究還發(fā)現(xiàn),在多種類型腫瘤的化療藥物抵抗中,NOTCH信號通路也有不同程度的參與。其中,在黑素瘤細(xì)胞中過表達(dá)NOTCH1分子活性片段引起細(xì)胞對BRAF抑制劑威羅菲尼的GI50值出現(xiàn)明顯上升,提示NOTCH信號通路的活化可以引起黑素瘤細(xì)胞產(chǎn)生針對BRAF抑制劑的治療抵抗。因此,探索NOTCH通路在黑素瘤靶向治療中的作用十分重要,可能對黑素瘤治療提供新的策略。綜上所述,NOTCH信號通路是黑素瘤中重要的促癌通路,通過抑制該通路活性來治療黑素瘤是一個新穎且具有良好前景的策略,結(jié)合近年來的相關(guān)研究結(jié)果,我們認(rèn)為NOTCH信號通路在黑素細(xì)胞衰老逃逸和黑素瘤的BRAF抑制劑治療抵抗中起著十分關(guān)鍵的作用,并且可能是二者緊密聯(lián)系的重要機(jī)制之一。本項目擬通對研究NOTCH通路對癌基因誘導(dǎo)黑素細(xì)胞衰老的影響及NOTCH通路抑制劑聯(lián)合BRAF抑制劑在黑素瘤治療中的效果,以期了解NOTCH通路在黑素細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用,豐富和完善黑素瘤發(fā)病機(jī)制,并為黑素瘤的治療探索新思路。研究目的1.研究活化的NOTCH信號對癌基因誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞衰老的影響。2.分析NOTCH通路抑制劑對黑素瘤細(xì)胞衰老的影響及其機(jī)制。3.探索NOTCH通路抑制劑聯(lián)合BRAF抑制劑在黑素瘤治療中的應(yīng)用效果及其機(jī)制。研究方法1.利用免疫組化染色在黑素瘤和黑素細(xì)胞痣皮損切片中檢測活性NOTCH1表達(dá);利用Western blot和Real-time PCR技術(shù)在黑素瘤細(xì)胞系和正常人黑素細(xì)胞中檢測活性NOTCH1分子及下游靶基因表達(dá),明確NOTCH1信號在黑素細(xì)胞良惡性皮損中的活化差異。2.利用慢病毒載體轉(zhuǎn)染正常人黑素細(xì)胞,建立NOTCH1 intracellular domain(N1ICD)過表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞研究體系,觀察活化的NOTCH1信號對正常人黑素細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。同時通過轉(zhuǎn)染共表達(dá)癌基因BRAFV600E、NRASQ61R,觀察活化的NOTCH1對癌基因誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的影響。3.篩選高表達(dá)NOTCH1的人黑素瘤細(xì)胞系,利用NOTCH通路阻斷劑——γ-分泌酶抑制劑DAPT處理后,觀察黑素瘤細(xì)胞的衰老表型。4.利用攜帶BRAFV600突變的黑素瘤細(xì)胞系,聯(lián)合應(yīng)用BRAF抑制劑威羅菲尼及NOTCH抑制劑DAPT進(jìn)行臨床前期實驗,對比聯(lián)合療法與單藥治療的效果,觀察黑素瘤細(xì)胞耐藥性的差異,并探討相關(guān)作用機(jī)制。5.利用慢病毒載體轉(zhuǎn)染攜帶BRAFV600突變的黑素瘤細(xì)胞,建立過表達(dá)N1ICD的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,觀察活化的NOTCH1對威羅菲尼治療抵抗的影響及對DAPT聯(lián)合治療的反應(yīng)。主要研究結(jié)果1.NOTCH通路活性在黑素瘤皮損和細(xì)胞系中顯著增高:免疫組化結(jié)果表明活化的NOTCH1分子在黑素細(xì)胞痣中不表達(dá),而在黑素瘤切片中高表達(dá);Western blot和Real-time PCR結(jié)果提示:相比于正常人黑素細(xì)胞,NOTCH通路活性在黑素瘤細(xì)胞系中明顯增強(qiáng)2.活性NOTCH1過表達(dá)可以阻止癌基因誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞衰老:經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染NOTCH1活性片段后,正常人黑素細(xì)胞出現(xiàn)了惡性轉(zhuǎn)化;同時共表達(dá)癌基因BRAFV600E、NRASQ61R后,正常人黑素細(xì)胞出現(xiàn)衰老表型,而過表達(dá)NOTCH1活性片段的細(xì)胞則未出現(xiàn)衰老表型。3.NOTCH抑制劑誘導(dǎo)黑素瘤細(xì)胞衰老:經(jīng)NOTCH抑制劑DAPT處理后黑素瘤細(xì)胞生長受到抑制并出現(xiàn)了衰老表型。4.NOTCH抑制劑與BRAF抑制劑對黑素瘤生長有協(xié)同抑制作用:DAPT與威羅菲尼對黑素瘤細(xì)胞生長產(chǎn)生協(xié)同抑制作用,并可明顯抑制黑素瘤細(xì)胞對BRAF抑制劑產(chǎn)生的治療抵抗。5.機(jī)制探討及靶分子的確定:細(xì)胞凋亡及衰老表型檢測提示DAPT對威羅菲尼的協(xié)同抑制作用主要依賴于對細(xì)胞衰老而非凋亡的誘導(dǎo);Western blot確定DAPT可以抑制CDK6蛋白的表達(dá),并有效抑制RB蛋白磷酸化。結(jié)論通過本課題的研究,我們首次發(fā)現(xiàn)了在正常人黑素細(xì)胞中激活NOTCH信號可阻止癌基因誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老,而在黑素瘤中,抑制NOTCH信號可以誘導(dǎo)細(xì)胞衰老;此外,本研究首次證實了NOTCH抑制劑聯(lián)合BRAF抑制劑對攜帶BRAFV600突變的黑素瘤細(xì)胞具有協(xié)同抑制作用,可以明顯延遲黑素瘤細(xì)胞對BRAF抑制劑的治療抵抗。我們的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步完善了NOTCH信號通路在黑素瘤中的促癌作用并對攜帶BRAFV600突變的黑素瘤治療提供了新的策略。
【關(guān)鍵詞】：NOTCH信號通路 黑素瘤 細(xì)胞衰老 BRAF抑制劑 治療抵抗
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R739.5
【目錄】：

• 縮略語表4-7
• 中文摘要7-11
• Abstract11-16
• 前言16-17
• 文獻(xiàn)回顧17-32
• 1 材料32-46
• 1.1 主要儀器設(shè)備32-33
• 1.2 主要實驗試劑33-37
• 1.3 其它材料37-42
• 1.4 實驗溶液配方42-46
• 2 方法46-70
• 2.1 NOTCH通路活性在黑素細(xì)胞良惡性皮損及細(xì)胞系中的檢測46-52
• 2.2 N1ICD過表達(dá)對正常人黑素細(xì)胞生物學(xué)行為的影響52-65
• 2.3 NOTCH抑制劑對黑素瘤細(xì)胞衰老的誘導(dǎo)作用65-66
• 2.4 NOTCH抑制劑與BRAF抑制劑聯(lián)合治療黑素瘤的臨床前期實驗66-70
• 3 結(jié)果70-90
• 3.1 NOTCH通路活性在黑素瘤皮損和細(xì)胞系中顯著增高70-72
• 3.2 活化NOTCH通路阻斷癌基因誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞衰老72-78
• 3.3 NOTCH通路抑制劑誘導(dǎo)黑素瘤細(xì)胞衰老78-81
• 3.4 NOTCH抑制劑與BRAF抑制劑對黑素瘤細(xì)胞的協(xié)同作用81-90
• 4 討論90-99
• 小結(jié)99-100
• 參考文獻(xiàn)100-117
• 個人簡歷和研究成果117-119
• 致謝119-120

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2 李玲,周華,宋偉民,蘇瑾;長波紫外線照射對小鼠黑素瘤細(xì)胞的影響[J];環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué);2004年01期

3 劉厚廣;李琛;尤艷;李海燕;孫桂珍;;黑素瘤細(xì)胞生長因子表達(dá)及微血管密度研究[J];臨床皮膚科雜志;2006年07期

4 朱健偉;駱丹;;黑素瘤細(xì)胞粘附與遷移相關(guān)表面分子研究進(jìn)展[J];腫瘤基礎(chǔ)與臨床;2006年06期

5 馬楓茹;劉琨;張毅;潘石;吳世法;;單個人體黑素瘤細(xì)胞的原子力顯微圖像及拉曼光譜的研究[J];電子顯微學(xué)報;2007年01期

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本文編號：864237