發(fā)布時間：2017-09-05 21:53

  本文關鍵詞：Prdx2保護真皮間充質干細胞抑制皮膚衰老的機制研究

  更多相關文章： 真皮間充質干細胞 皮膚衰老 細胞衰老 過氧化物還原酶Ⅱ 基因敲除小鼠

【摘要】：Prdx2(Peroxiredoxin Ⅱ)是一種廣泛存在于機體組織細胞中的過氧化物還原酶,具有及時清除體內較低濃度活性氧(ROS)的作用。經過長時間的研究發(fā)現,Prdx2基因敲除小鼠的胚胎成纖維細胞(MEF)表現出嚴重的細胞衰老特征,而且Prdx2基因敲除鼠出現了明顯的皮膚衰老癥狀,表現為全層皮膚厚度減少、表皮角質層增厚、真皮層明顯變薄,這些現象顯示出了Prdx2在皮膚衰老過程中可能的重要作用。雖然Prdx2的功能得到了較為廣泛的研究,但是缺失Prdx2引起皮膚衰老的原因和Prdx2在真皮間充質干細胞修復衰老皮膚組織中的作用機理仍然未知。為了進一步探究Prdx2在延緩皮膚衰老和保護真皮間充質干細胞(DMSCs)中的分子機制,本實驗利用Prdx2基因敲除模式鼠,研究Prdx2在真皮間充質干細胞延緩皮膚衰老過程中的作用,闡明Prdx2保護真皮間充質干細胞防止皮膚提前衰老的分子機制。首先,在體內部分,本實驗利用3月齡(Young)、8月齡(Middle Age)、11月齡(Aged)Prdx2基因敲除型小鼠和野生型小鼠,采用HE染色和Masson膠原染色的方法觀察其皮膚組織變化;通過背部全層皮膚損傷修復情況評估皮膚功能;通過蛋白免疫印跡(Western Blot)的方法檢測皮膚組織中與衰老和增殖相關的蛋白表達水平。其次,在細胞部分,本實驗利用流式細胞術(FACS)對真皮間充質干細胞進行鑒定,并檢測不同代次(Passages)真皮間充質干細胞的細胞周期(Cell Cycle)、細胞凋亡(Apoptosis)水平;利用SA-β-gal染色方法檢測真皮間充質干細胞衰老情況;利用MTT繪制生長曲線;利用Western Blot檢測相關蛋白表達水平。第三,在分子部分,通過細胞免疫熒光染色,通過核蛋白抽提(Nucleoprotein extraction)和蛋白免疫印跡觀察β-catenin入核水平和其他關鍵信號蛋白表達水平,闡明Prdx2調控經典Wnt/β-catenin信號的分子機制。在體內水平HE染色及Masson膠原染色結果顯示隨著小鼠月齡的增加真皮層厚度逐漸減少,且相同月齡的Prdx2基因敲除型小鼠的真皮厚度小于野生型小鼠的真皮層厚度;皮膚損傷愈合實驗顯示基因敲除型小鼠背部全層皮膚傷口愈合速度慢于野生型小鼠;Western Blot結果顯示隨著小鼠月齡的增加皮膚組織中p21、p16的表達量增加且相同月齡敲除型高于野生型,stat3的磷酸化水平和PCNA表達量降低且敲除型低于野生型。在細胞水平,隨著小鼠真皮間充質干細胞的代次增加,細胞周期發(fā)生了G0/G1期阻滯且相同代次敲除型阻滯比例更高;SA-β-gal染色結果顯示隨著代次增加細胞衰老比例增加,相同代次敲除型小鼠真皮間充質干細胞細胞衰老比例明顯高于野生型;增殖曲線顯示,3P時兩基因型小鼠真皮間充質干細胞增殖速度無差異,隨代次增多敲除型增殖速度明顯低于野生型;Western Blot結果顯示隨代次增加p21、p16的表達量增加且相同代次敲除型高于野生型stat3的磷酸化水平和PCNA表達量降低且敲除型低于野生型。在分子水平,細胞免疫熒光染色和Western Blot結果顯示,Prdx2基因敲除型小鼠真皮間充質干細胞的β-catenin入核增加,GSK3β(Ser9)和Akt磷酸化水平增加。以上結果表明,Prdx2可以調控經典Wnt/β-catenin信號通路保護小鼠真皮間充質干細胞使其維持正常的數量和功能,Prdx2的缺失會導致Wnt/β-catenin信號通路的異常激活,從而造成真皮間充質干細胞的提前衰老,進而導致了Prdx2敲除型小鼠皮膚的提前衰老和傷口愈合能力的下降。
【關鍵詞】：真皮間充質干細胞 皮膚衰老 細胞衰老 過氧化物還原酶Ⅱ 基因敲除小鼠
【學位授予單位】：黑龍江八一農墾大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R751
【目錄】：

• 摘要8-10
• 英文摘要10-12
• 1 文獻綜述12-22
• 1.1 引言12
• 1.2 皮膚衰老的研究進展12-18
• 1.2.1 干細胞與皮膚衰老12-15
• 1.2.2 活性氧與皮膚衰老15-16
• 1.2.3 信號通路與皮膚衰老16-18
• 1.3 Prdx2研究進展18-20
• 1.3.1 Prdx2基因功能研究18-19
• 1.3.2 Prdx2與Wnt信號19-20
• 1.4 研究意義20-22
• 2 材料與方法22-30
• 2.1 實驗材料22-25
• 2.1.1 Prdx2基因敲除小鼠22
• 2.1.2 主要試劑和儀器22-25
• 2.2 試驗方法25-30
• 2.2.1 小鼠基因型鑒定25-26
• 2.2.2 小鼠皮膚組織H&E染色26
• 2.2.3 小鼠皮膚組織Masson膠原染色26
• 2.2.4 免疫印跡（Western Blot）檢測蛋白表達變化26-27
• 2.2.5 小鼠真皮間充質干細胞提取27
• 2.2.6 小鼠真皮間充質干細胞鑒定27
• 2.2.7 細胞周期檢測27-28
• 2.2.8 細胞凋亡檢測28
• 2.2.9 生長曲線繪制28
• 2.2.10 SA-β-gal染色28
• 2.2.11 細胞免疫熒光染色28-30
• 3 結果與分析30-42
• 3.1 Prdx2缺失導致小鼠皮膚提前衰老30-34
• 3.1.1 Prdx2基因敲除小鼠與野生型小鼠皮膚組織染色30-31
• 3.1.2 Prdx2基因敲除小鼠與野生型小鼠皮膚組織相關蛋白表達檢測31-33
• 3.1.3 Prdx2敲除型小鼠與野生型小鼠皮膚全層傷口愈合速度檢測33-34
• 3.2 小鼠真皮間充質干細胞鑒定34-35
• 3.3 Prdx2缺失導致小鼠真皮間充質干細胞提前衰老35-39
• 3.3.1 連續(xù)傳代的兩種基因型小鼠真皮間充質干細胞的細胞周期檢測36-37
• 3.3.2 連續(xù)傳代的兩種基因型小鼠真皮間充質干細胞的增殖能力37-38
• 3.3.3 連續(xù)傳代的兩種基因型小鼠真皮間充質干細胞的細胞凋亡水平38
• 3.3.4 連續(xù)傳代的兩種基因型小鼠真皮間充質干細胞的衰老水平38-39
• 3.4 Prdx2缺失導致真皮間充質干細胞經典Wnt/β-catenin信號異常激活39-42
• 3.4.1 Prdx2敲除導致Wnt/β-catenin累積并入核39-40
• 3.4.2 Prdx2敲除導致GSK3β活性降低40-42
• 4 討論42-46
• 5 結論46-48
• 參考文獻48-54
• 致謝54-56
• 附錄56-60
• 個人簡介60

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